| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 第一章 引言 | 第9-16页 |
| 1 杆状病毒简述 | 第9页 |
| ·杆状病毒分类 | 第9页 |
| ·杆状病毒的生活周期 | 第9页 |
| 2 杆状病毒的研究进展 | 第9-10页 |
| ·杆状病毒的序列 | 第9-10页 |
| ·杆状病毒基因表达调控 | 第10页 |
| 3 杆状病毒晚期基因表达因子 LEFS 研究进展 | 第10-12页 |
| ·杆状病毒晚期基因表达因子 LEFs 研究概况 | 第10-11页 |
| ·杆状病毒 LEFs 基因的功能 | 第11页 |
| ·参与病毒 DNA 复制的 lef 基因 | 第11-12页 |
| ·其他 lef 基因的功能 | 第12页 |
| 4 家蚕生物反应器概述 | 第12-13页 |
| 5 RED 重组技术的研究进展 | 第13页 |
| 6 实验方案设计 | 第13-16页 |
| ·研究的目的和意义 | 第13页 |
| ·研究内容 | 第13-15页 |
| ·实验流程 | 第15-16页 |
| 第二章 LEF-9 的生物信息学分析 | 第16-21页 |
| 1 生物信息学简介 | 第16页 |
| 2 生物信息学工具 | 第16页 |
| 3 结果 | 第16-20页 |
| ·lef-9 基因序列分析 | 第16-17页 |
| ·LEF-9 蛋白的疏水性分析 | 第17-18页 |
| ·LEF-9 蛋白的信号肽分析 | 第18-19页 |
| ·LEF-9 蛋白的跨膜区分析 | 第19-20页 |
| ·LEF-9 蛋白的二级结构分析 | 第20页 |
| 4 讨论 | 第20-21页 |
| 第三章 家蚕核型多角体病毒 lef-9 缺失型和补回型病毒的构建 | 第21-32页 |
| 1 材料与试剂 | 第21-23页 |
| ·材料 | 第21页 |
| ·试剂 | 第21页 |
| ·试剂配制 | 第21-23页 |
| 2 方法 | 第23-27页 |
| ·含有 pKD46 质粒的 DH10Bac 菌的感受态制备 | 第23页 |
| ·lef-9 基因打靶线性片段的制备 | 第23-24页 |
| ·lef-9 基因缺失型 Bacmid 的获得与 PCR 鉴定 | 第24-25页 |
| ·通过同源重组获得 lef-9 缺失型 Bacmid | 第24页 |
| ·lef-9 缺失型 Bacmid 的获得 | 第24页 |
| ·重组 Bacmid 的 PCR 鉴定 | 第24-25页 |
| ·转移载体 pFastBacHTB-lef-9 的构建 | 第25-26页 |
| ·lef-9 基因的 PCR 扩增 | 第25页 |
| ·碱法提取 pFastBacHTB 质粒 | 第25-26页 |
| ·目的片段与载体的双酶切 | 第26页 |
| ·双酶切产物的连接反应 | 第26页 |
| ·lef-9 补回型 Bacmid 的构建 | 第26-27页 |
| ·缺失型 Bacmid 感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·质粒 pFastBacHTB-lef-9 转化 lef-9 缺失型 Bacmid 感受态细胞 | 第27页 |
| ·lef-9 基因补回型 Bacmid 的 PCR 鉴定 | 第27页 |
| 3 结果 | 第27-31页 |
| ·lef-9 基因打靶线性化片段的 PCR 鉴定 | 第27-28页 |
| ·lef-9 基因缺失型病毒 lef-9-KO-Bacmid 的鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组转移载体 pFastBacHTB-lef-9 的 PCR 和双酶切鉴定 | 第29-30页 |
| ·lef-9 基因补回型病毒 lef-9-Re-Bacmid 的鉴定 | 第30-31页 |
| 4 讨论 | 第31-32页 |
| 第四章 lef-9 缺失对 BmNPV 复制及各时期基因转录的影响 | 第32-52页 |
| 1 材料与试剂 | 第32页 |
| ·材料 | 第32页 |
| ·试剂 | 第32页 |
| 2 方法 | 第32-38页 |
| ·家蚕细胞 BmN 的培养 | 第32-33页 |
| ·细胞冻存 | 第32-33页 |
| ·细胞复苏 | 第33页 |
| ·家蚕 BmN 细胞的传代培养 | 第33页 |
| ·病毒 DNA 的提取 | 第33页 |
| ·脂质体介导病毒 DNA 转染家蚕 BmN 细胞 | 第33页 |
| ·病毒滴度测定 | 第33-34页 |
| ·病毒基因组的提取和消化 | 第34页 |
| ·病毒基因组的提取 | 第34页 |
| ·DpnⅠ消化 | 第34页 |
| ·qPCR 分析 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第34-35页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第35页 |
| ·荧光定量 PCR | 第35页 |
| ·胞内总 RNA 的提取 | 第35-36页 |
| ·DNase I 处理 RNA | 第36页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第36-37页 |
| ·荧光定量 PCR 引物的设计 | 第37页 |
| ·荧光定量 PCR | 第37-38页 |
| ·荧光定量 PCR 数据分析 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-50页 |
| ·病毒滴度测定 | 第38-39页 |
| ·lef-9 基因缺失对病毒 DNA 复制的 qPCR 分析 | 第39-42页 |
| ·标准曲线的测定 | 第39-40页 |
| ·lef-9-KO-Bacmid、lef-9-Re-Bacmid 和 wtBacmid 基因组复制的 qPCR 分析 | 第40-42页 |
| ·病毒早期基因 lef-3 转录的 qRT-PCR 分析 | 第42-44页 |
| ·病毒早期基因 ie-1 转录的 qRT-PCR 分析 | 第44-46页 |
| ·病毒晚期基因 vp39 转录的 qRT-PCR 分析 | 第46-48页 |
| ·病毒极晚期基因 p10 转录的 qRT-PCR 分析 | 第48-50页 |
| 4 讨论 | 第50-52页 |
| 第五章 lef-9 缺失对 BmNPV 基因表达的影响 | 第52-55页 |
| 1 材料与试剂 | 第52页 |
| ·材料 | 第52页 |
| ·主要试剂的配制 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-53页 |
| ·LEF-9 蛋白在 BmN 细胞中 SDS-PAGE | 第52-53页 |
| ·Western blot 检测蛋白的表达 | 第53页 |
| 3 | 第53-54页 |
| ·Western blot 鉴定 LEF-9 蛋白 | 第53页 |
| ·Westren blot 检测蛋白的表达情况 | 第53-54页 |
| ·Westren blot 检测 LEF-3、P10、VP39 蛋白的表达 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第六章 电子显微镜观察 | 第55-60页 |
| 1 材料与试剂 | 第55-56页 |
| ·材料 | 第55页 |
| ·主要试剂的配制 | 第55-56页 |
| 2 电子显微镜分析 | 第56-57页 |
| ·病毒感染的 BmN 细胞的收集 | 第56页 |
| ·制样 | 第56-57页 |
| 3 结果 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
