| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略语 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-23页 |
| 1 SARS-COV 及 SARS 疫苗的研究进展 | 第15-20页 |
| ·SARS-CoV 基因组的结构 | 第15-17页 |
| ·SARS-CoV 的结构蛋白及其各自的功能 | 第17-19页 |
| ·棘突蛋白（Spike protein） | 第17-18页 |
| ·核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein） | 第18页 |
| ·包膜蛋白（Membrane protein） | 第18页 |
| ·小包膜蛋白（Small Envelope protein） | 第18-19页 |
| ·SARS 疫苗的研究进展 | 第19-20页 |
| 2 家蚕核型多角体病毒表达体系的研究进展 | 第20-23页 |
| ·家蚕核型多角体病毒及其侵染机制 | 第20-21页 |
| ·高效 Bac-to-Bac 系统 | 第21页 |
| ·杆状病毒表面展示技术 | 第21-22页 |
| ·家蚕生物反应器表达载体系统的优点 | 第22-23页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第23-26页 |
| 1 实验目的和意义 | 第23页 |
| 2 实验内容 | 第23-25页 |
| 3 实验流程图 | 第25-26页 |
| 第三章 SARS-CoV N、RBD 蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第26-44页 |
| 1 材料与试剂 | 第26-27页 |
| ·材料 | 第26页 |
| ·试剂 | 第26页 |
| ·试剂配制 | 第26-27页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第26-27页 |
| ·ELISA 试剂 | 第27页 |
| ·其他试剂配制 | 第27页 |
| 2 实验方法 | 第27-37页 |
| ·N、RBD 的核苷酸序列及氨基酸序列 | 第27-29页 |
| ·重组表达载体 pET-28a-N、pET-28a-RBD 的构建 | 第29-33页 |
| ·基因 N、RBD 的克隆 | 第29-31页 |
| ·PCR 产物与载体 pET-28a 双酶切 | 第31页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第31-32页 |
| ·连接反应 | 第32页 |
| ·E.coli TG1 和 E.coli BL 21 感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组质粒 pET-28a-N/pET-28a-RBD 的转化及鉴定 | 第33页 |
| ·N、RBD 蛋白的表达 | 第33-34页 |
| ·SDS-PAGE 检测分析 | 第34页 |
| ·制胶 | 第34页 |
| ·制样及电泳分析 | 第34页 |
| ·N、RBD 蛋白的纯化 | 第34-36页 |
| ·N 蛋白的亲和层析纯化 | 第34-35页 |
| ·RBD 蛋白的亲和层析纯化 | 第35-36页 |
| ·RBD 蛋白包涵体的洗涤 | 第35页 |
| ·RBD 蛋白的亲和层析 | 第35页 |
| ·Millipore 复性浓缩 | 第35-36页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第36页 |
| ·双向电泳及质谱鉴定 | 第36页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第36-37页 |
| ·免疫动物 | 第36页 |
| ·多克隆抗血清的制备及纯化 | 第36页 |
| ·多克隆抗体效价测定 | 第36-37页 |
| 3 结果 | 第37-42页 |
| ·N、RBD 基因的 PCR 扩增 | 第37页 |
| ·重组质粒 pET-28a-N、pET-28a-RBD 的 PCR 与双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| ·测序鉴定 | 第38页 |
| ·N、RBD 蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第38-39页 |
| ·双向电泳及质谱鉴定 | 第39-41页 |
| ·多克隆抗体效价的测定 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42-44页 |
| 第四章 构建家蚕杆状病毒表面展示系统重组转移载体 | 第44-60页 |
| 1 材料与试剂 | 第44-45页 |
| ·材料 | 第44页 |
| ·试剂 | 第44页 |
| ·试剂配制 | 第44-45页 |
| ·LB 固体培养基（Ampicillin，Amp；Gentamicin，Gen） | 第44页 |
| ·抗生素 | 第44页 |
| ·其他试剂 | 第44-45页 |
| 2 实验方法 | 第45-57页 |
| ·重组转移载体 pFastBacdual-gp64-N 的构建 | 第45-51页 |
| ·SP、TM、N 基因的扩增 | 第45-49页 |
| ·gp64 信号肽（SP）基因的扩增 | 第45-46页 |
| ·gp64 跨膜区（TM）的扩增 | 第46-47页 |
| ·SARS-CoV 的 N 基因扩增 | 第47-48页 |
| ·gp64-N 的获得 | 第48页 |
| ·gp64-N 的扩增 | 第48-49页 |
| ·PCR 产物与质粒 pFastBacdual 双酶切 | 第49-50页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第50页 |
| ·连接反应 | 第50页 |
| ·连接产物的转化 | 第50页 |
| ·重组质粒 pFastBacdual-gp64-N 的筛选与鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组转移载体 pFastBacdual-gp64-RBD 的构建 | 第51-56页 |
| ·SP、TM、RBD 基因的扩增 | 第51-54页 |
| ·gp64 信号肽（SP）基因的扩增 | 第51-52页 |
| ·gp64 跨膜区（TM）的扩增 | 第52页 |
| ·SARS-CoV 的 RBD 基因扩增 | 第52-53页 |
| ·gp64-RBD 的获得 | 第53页 |
| ·gp64-RBD 的扩增 | 第53-54页 |
| ·PCR 产物与质粒 pFastBacdual 的双酶切 | 第54-55页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第55页 |
| ·连接反应 | 第55页 |
| ·连接产物的转化 | 第55页 |
| ·重组质粒 pFastBacdual-gp64-RBD 的筛选与鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组转移载体 pFastBacdual-gp64-N-RBD 的构建 | 第56-57页 |
| ·重组载体 pFastBacdual-gp64-N 的双酶切 | 第56页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第56页 |
| ·连接反应 | 第56页 |
| ·连接产物的转化 | 第56-57页 |
| ·重组质粒 pFastBacdual-gp64-N-RBD 的筛选与鉴定 | 第57页 |
| ·菌种保存 | 第57页 |
| 3 结果 | 第57-59页 |
| ·gp64-N 与 gp64-RBD 序列的扩增 | 第57-58页 |
| ·重组转移载体 pFastBacdual-gp64-N、pFastBacdual-gp64-RBD 的 PCR、双酶切鉴定 | 第58页 |
| ·重组转移载体 pFastBacdual-gp64-N-RBD 的 PCR、双酶切鉴定 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-60页 |
| 第五章 SARS-CoV 的 N、RBD 蛋白展示于家蚕杆状病毒表面 | 第60-84页 |
| 1 材料与试剂 | 第60-62页 |
| ·材料 | 第60页 |
| ·试剂 | 第60页 |
| ·试剂配制 | 第60-62页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·提取 Bacmid 溶液 | 第61页 |
| ·家蚕细胞培养基 | 第61页 |
| ·细胞冻存液 | 第61页 |
| ·Western blotting 溶液 | 第61页 |
| ·其他试剂 | 第61-62页 |
| 2 实验方法 | 第62-70页 |
| ·重组 Bacmidgp64-N、Bacmidgp64-RBD、Bacmidgp64-N-RBD 的构建与鉴定 | 第62-64页 |
| ·E.coli DH10Bac 感受态细胞的制备 | 第62页 |
| ·重组质粒的转化 | 第62页 |
| ·重组 Bacmid 的提取 | 第62-63页 |
| ·重组 Bacmid 的 PCR 鉴定 | 第63-64页 |
| ·BmN 细胞的复苏、培养与冻存 | 第64-65页 |
| ·BmN 细胞复苏及培养 | 第64-65页 |
| ·细胞的冻存 | 第65页 |
| ·家蚕杆状病毒的培养 | 第65页 |
| ·家蚕杆状病毒基因组的提取 | 第65页 |
| ·重组 Bacmid 转染家蚕 BmN 细胞 | 第65-66页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 基因组的提取及鉴定 | 第66页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 的培养 | 第66页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 滴度测定 | 第66-68页 |
| ·RT-PCR 引物的设计 | 第66页 |
| ·RT-PCR 标准曲线的绘制 | 第66-67页 |
| ·重组杆状病毒滴度的测定 | 第67-68页 |
| ·N、RBD 蛋白在家蚕 BmN 细胞的表达及分离纯化 | 第68页 |
| ·N、RBD 蛋白在家蚕 BmN 细胞中的表达 | 第68页 |
| ·N、RBD 蛋白在家蚕 BmN 细胞中的纯化 | 第68页 |
| ·SDS-PAGE 及 Western blotting 鉴定 | 第68页 |
| ·激光共聚焦显微镜分析 N、RBD 蛋白表面展示 | 第68-69页 |
| ·N、RBD 蛋白在家蚕五龄幼虫、蚕蛹中的表达及鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 接种家蚕五龄幼虫 | 第69页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 接种蚕蛹 | 第69页 |
| ·SDS-PAGE 及 Western blotting 鉴定 | 第69-70页 |
| 3 结果 | 第70-82页 |
| ·重组 Bacmidgp64-N、Bacmidgp64-RBD 的 PCR 鉴定 | 第70-71页 |
| ·重组 Bacmidgp64-N-RBD 的 PCR 鉴定 | 第71-72页 |
| ·重组杆状病毒基因组 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD 的 PCR 鉴定 | 第72-73页 |
| ·重组杆状病毒基因组 vBmgp64-N-RBD 的 PCR 鉴定 | 第73-74页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 滴度测定 | 第74-77页 |
| ·RT-PCR 标准曲线的绘制 | 第74-75页 |
| ·重组杆状病毒滴度的测定 | 第75-77页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 在家蚕细胞中目的蛋白的表达鉴定 | 第77-79页 |
| ·激光共聚焦显微镜分析 N、RBD 蛋白表面展示 | 第79-81页 |
| ·N、RBD 蛋白在家蚕五龄幼虫、蚕蛹中的表达鉴定 | 第81-82页 |
| 4 讨论 | 第82-84页 |
| 第六章 重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 的免疫原性研究 | 第84-90页 |
| 1 材料与试剂 | 第84页 |
| ·材料 | 第84页 |
| ·试剂 | 第84页 |
| 2 实验方法 | 第84-85页 |
| ·重组杆状病毒 vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD 免疫小鼠 | 第84页 |
| ·抗体的效价测定 | 第84-85页 |
| ·血清中和实验 | 第85页 |
| 3 结果 | 第85-88页 |
| ·抗体效价的测定 | 第85-86页 |
| ·血清中和实验 | 第86-88页 |
| 4 讨论 | 第88-90页 |
| 结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
