| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 縮略语表 | 第13-15页 |
| 1 前言 | 第15-39页 |
| ·共生固氮的概念和意义 | 第15-21页 |
| ·共生体根瘤的形成过程 | 第15-16页 |
| ·结瘤因子的感知与信号转导途径 | 第16-21页 |
| ·结瘤因子的感知 | 第16-18页 |
| ·结瘤因子信号转导途径 | 第18-21页 |
| ·豆科植物中的共生受体激酶 | 第21-26页 |
| ·植物中的受体蛋白激酶 | 第21页 |
| ·共生受体激酶SYMRK | 第21-26页 |
| ·共生受体激酶SYMRK的结构与功能研究 | 第21-23页 |
| ·共生受体激酶SYMRK的互作蛋白 | 第23-26页 |
| ·蛋白质的泛素化修饰 | 第26-33页 |
| ·蛋白质泛素化的概念与意义 | 第26-29页 |
| ·泛素化信号 | 第26-27页 |
| ·参与泛素化过程的酶 | 第27-28页 |
| ·蛋白质泛素化场所 | 第28-29页 |
| ·蛋白质泛素化修饰的功能 | 第29-33页 |
| ·蛋白质泛素化降解功能 | 第29-31页 |
| ·非蛋白质泛素化降解功能 | 第31-33页 |
| ·泛素连接酶 | 第33-38页 |
| ·泛素连接酶的分类及特征 | 第33-36页 |
| ·HECT家族的泛素连接酶 | 第33-34页 |
| ·RING-FINGER家族的泛素连接酶 | 第34-36页 |
| ·泛素连接酶的作用机制 | 第36-37页 |
| ·泛素连接酶参与豆科植物根瘤菌侵染及根瘤形成 | 第37-38页 |
| ·研究的目的与意义 | 第38-39页 |
| 2 材料与方法 | 第39-63页 |
| ·载体和菌株 | 第39-41页 |
| ·植物材料 | 第41页 |
| ·蛋白质酵母体内相互作用的验证-酵母双杂交系统 | 第41-46页 |
| ·酵母培养基 | 第41-42页 |
| ·酵母双杂交相关试剂 | 第42-43页 |
| ·酵母转化 | 第43-44页 |
| ·醋酸锂(LIAC)高效转化酵母方法一(CLONTECH) | 第43-44页 |
| ·LIAC法高效转化酵母方法二(THE LAB OF GIETZ,CANADA) | 第44页 |
| ·酵母小范围MATING | 第44-45页 |
| ·B-半乳糖苷酶活性检测 | 第45-46页 |
| ·体外蛋白PULL-DOWN分析蛋白质之间的相互作用 | 第46-50页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 | 第46-47页 |
| ·蛋白质纯化试剂 | 第47页 |
| ·WESTERN BLOT试剂 | 第47-48页 |
| ·目标蛋白诱导表达 | 第48页 |
| ·融合蛋白的BINDING与纯化 | 第48-49页 |
| ·CBD(CHITIN BINDING DOMAIN)融合蛋白的BINDING | 第48页 |
| ·HIS-TAG融合蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| ·体外PULL-DOWN实验 | 第49页 |
| ·WESTERN BLOTTING | 第49-50页 |
| ·双分子荧光互补(BIFC)实验 | 第50-51页 |
| ·青色荧光的检测 | 第50-51页 |
| ·烟草体内瞬时表达异源蛋白的检测 | 第51页 |
| ·免疫共沉淀法检测蛋白质之间的相互作用 | 第51-53页 |
| ·烟草体内蛋白的表达 | 第51页 |
| ·烟草中表达蛋白的提取 | 第51-52页 |
| ·免疫共沉淀 | 第52-53页 |
| ·HIS-TAG SIE3体外泛素连接酶活性检测 | 第53-54页 |
| ·HIS-TAG SIE3纯化蛋白的制备 | 第53页 |
| ·体外泛素连接酶活性实验 | 第53-54页 |
| ·烟草体内泛素化底物检测分析 | 第54-55页 |
| ·烟草叶片中蛋白的共表达 | 第54页 |
| ·泛素化底物检测 | 第54-55页 |
| ·植物中蛋白降解分析 | 第55-56页 |
| ·植物体内蛋白降解实验 | 第55页 |
| ·半体外蛋白降解实验分析 | 第55-56页 |
| ·表达分析 | 第56-58页 |
| ·总RNA的抽提 | 第56页 |
| ·REAL-TIME PCR | 第56-58页 |
| ·REAL-TIME PCR引物设计及检验 | 第57页 |
| ·反转录反应 | 第57页 |
| ·REAL-TIME PCR反应及检测 | 第57-58页 |
| ·亚细胞定位分析 | 第58-60页 |
| ·LJSIE3在洋葱表皮细胞中的定位 | 第58-59页 |
| ·农杆菌介导洋葱表皮细胞的转化 | 第58页 |
| ·基因枪法转化洋葱表皮 | 第58-59页 |
| ·LJSIE3在百脉根毛根中的定位 | 第59页 |
| ·LJSIE3在烟草叶片中的亚细胞定位 | 第59-60页 |
| ·RNAI载体的构建 | 第60页 |
| ·毛根转化和鉴定 | 第60-62页 |
| ·常用试剂和培养基 | 第60-61页 |
| ·百脉根毛根转化 | 第61-62页 |
| ·根瘤菌接种 | 第62页 |
| ·转基因植株侵染线的观察 | 第62页 |
| ·分析软件及生物信息学网站 | 第62-63页 |
| 3 结果与分析 | 第63-96页 |
| ·新型泛素连接酶SIE3与百脉根受体激酶SYMRK的相关性研究 | 第63-77页 |
| ·SIE3的分离与克隆 | 第63页 |
| ·SIE3蛋白结构分析 | 第63-67页 |
| ·SIE3与SYMRK相互作用区段的鉴定 | 第67-70页 |
| ·SIE3与SYMRK在植物中的相互作用-BIFC分析 | 第70-71页 |
| ·免疫共沉淀方法验证SIE3与SYMRK的相互作用 | 第71-73页 |
| ·SIE3与SYMRK在烟草叶片中的瞬时表达 | 第71-72页 |
| ·免疫共沉淀分析 | 第72-73页 |
| ·SYMRK是SIE3的泛素化底物 | 第73-74页 |
| ·SIE3体外自泛素化活性检测 | 第73-74页 |
| ·植物体内SIE3介导SYMRK进行泛素化修饰 | 第74页 |
| ·SYMRK被泛素化修饰机制的探索研究 | 第74-77页 |
| ·SIE3与百脉根中ARID类转录因子SIP1之间生化关系的研究 | 第77-86页 |
| ·SIE3与SIP1在酵母中相互作用的研究 | 第77-78页 |
| ·BIFC分析SIE3与SIP1在植物中的相互作用 | 第78-79页 |
| ·SIP1在植物体内瞬时表达以及降解分析 | 第79-81页 |
| ·SIE3能促进SIP1的泛素化降解 | 第81-83页 |
| ·SIE3同源二聚体可能是促进SIP1降解所必须的 | 第83-86页 |
| ·SIE3在百脉根中的生物学功能分析 | 第86-94页 |
| ·REAL-TIME PCR检测SIE3基因在百脉根中的表达 | 第86-87页 |
| ·SIE3基因的亚细胞定位 | 第87-88页 |
| ·SIE3基因对百脉根中结瘤数的调控 | 第88-92页 |
| ·SIE3基因超表达引起结瘤数增加 | 第88-90页 |
| ·结瘤在SIE3的RNAI根中受到抑制 | 第90-92页 |
| ·结瘤素基因在SIE3-RNAI转基因根中的表达情况分析 | 第92页 |
| ·SIE3 RNAI转基因植株中根瘤菌侵染表型分析 | 第92-94页 |
| ·酵母双杂交筛选与SIE3相互作用的蛋白 | 第94-96页 |
| 4 总结与讨论 | 第96-104页 |
| ·总结 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97-104页 |
| ·SIE3是新类型的RING-FINGER E3泛素连接酶 | 第97-99页 |
| ·SYMRK是SIE3的泛素化底物 | 第99页 |
| ·SIE3介导SYMRK的非蛋白泛素化降解功能 | 第99-100页 |
| ·SIP1可能为SIE3的另一个泛素化底物 | 第100-101页 |
| ·SIP1可能以泛素化复合体形式被降解 | 第101-102页 |
| ·SIE3在结瘤因子信号转导过程中的生物学功能研究 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-119页 |
| 附录一：本研究所用引物 | 第119-121页 |
| 附录二：10X DROPOUT(DO)SUPPLEMENTS | 第121-122页 |
| 附录三：LJSIE3的CDNA和蛋白质序列 | 第122-123页 |
| 附录四：已发表的论文 | 第123-124页 |
| 致谢 | 第124页 |
