| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 第一章 猪链球菌2型的研究进展 | 第13-28页 |
| 1 病原学 | 第13-14页 |
| 2 流行病学 | 第14-15页 |
| 3 毒力因子 | 第15-21页 |
| ·荚膜多糖 | 第15页 |
| ·溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF) | 第15-17页 |
| ·猪链球菌溶血素(suilysin) | 第17页 |
| ·黏附素 | 第17-18页 |
| ·IgG结合蛋白 | 第18页 |
| ·纤维蛋白原结合蛋白(FBPS) | 第18-19页 |
| ·其它毒力相关因子 | 第19-21页 |
| ·分泌型核酸(secreted nuclease A,SsnA) | 第19页 |
| ·致病性基因—orf2 | 第19-20页 |
| ·38Kd免疫保护性抗原 | 第20页 |
| ·猪链球菌类细菌素抑制物 | 第20-21页 |
| 4 致病机理 | 第21-23页 |
| 5.猪链球菌的鉴定 | 第23-26页 |
| ·生化鉴定 | 第23页 |
| ·血清学鉴定 | 第23-24页 |
| ·分子鉴定 | 第24-26页 |
| ·限制性内切酶图谱分析法 | 第24-25页 |
| ·PCR | 第25页 |
| ·随机扩增核酸片段多肽性分析(RAPD) | 第25-26页 |
| 6.预防和治疗 | 第26页 |
| 7.协同性致病因子 | 第26-28页 |
| 第二章 感染猪链球菌2型后猪外周血细胞因子的变化 | 第28-39页 |
| 1 前言 | 第28页 |
| 2 材料和方法 | 第28-32页 |
| ·材料 | 第28-29页 |
| ·菌株 | 第28页 |
| ·试剂 | 第28-29页 |
| ·实验动物 | 第29页 |
| ·方法 | 第29-32页 |
| ·猪链球菌2型的培养 | 第29页 |
| ·猪链球菌2型计数 | 第29页 |
| ·动物致病性实验 | 第29页 |
| ·白细胞RNA的提取 | 第29-30页 |
| ·cDNA的合成 | 第30页 |
| ·引物设计,合成和融解曲线的检测 | 第30-31页 |
| ·cDNA PCR扩增鉴定和RNA样品中DNA检测 | 第31页 |
| ·荧光定量反应 | 第31页 |
| ·数据处理 | 第31-32页 |
| 3 结果 | 第32-36页 |
| ·猪的临床症状 | 第32页 |
| ·cDNA PCR扩增鉴定和RNA样品中DNA检测 | 第32-33页 |
| ·荧光定量PCR的融解曲线 | 第33-34页 |
| ·荧光定量PCR扩增细胞因子结果 | 第34-36页 |
| 4 讨论 | 第36-38页 |
| ·DNA的定量的研究 | 第36-37页 |
| ·各个细胞因子mRNA的表达 | 第37-38页 |
| 5 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 分泌核酸酶(SsnA)的生物学特性研究 | 第39-63页 |
| 1 前言 | 第39页 |
| 2 材料和方法 | 第39-53页 |
| ·材料 | 第39-44页 |
| ·菌株及质粒 | 第39页 |
| ·酶及主要试剂 | 第39-40页 |
| ·一抗和二抗 | 第40-41页 |
| ·免疫动物 | 第41页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第41页 |
| ·细菌培养基 | 第41页 |
| ·质粒抽提相关溶液 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液 | 第42页 |
| ·Western-blot及蛋白质斑点杂交缓冲液 | 第42-43页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第43页 |
| ·其他 | 第43-44页 |
| ·方法 | 第44-53页 |
| ·引物设计 | 第44页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第44页 |
| ·分泌核酸酶(SsnA)基因的克隆 | 第44-45页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第45页 |
| ·PCR产物与pET-28a载体的连接 | 第45页 |
| ·感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第45-46页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第46页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第46页 |
| ·重组表达质粒的转化和鉴定 | 第46页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达 | 第46-47页 |
| ·确定最佳的诱导表达条件 | 第47页 |
| ·小量诱导 | 第47页 |
| ·大量诱导 | 第47页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第47-48页 |
| ·免疫原的制备 | 第47页 |
| ·免疫程序 | 第47页 |
| ·ELISA检测免疫动物的抗体水平 | 第47-48页 |
| ·表达蛋白的鉴定 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE | 第48页 |
| ·Western-blot实验 | 第48-49页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·上清蛋白的提取 | 第49页 |
| ·镍亲和层析法(HisBind Purification Kit) | 第49页 |
| ·表达蛋白保护力效果测定 | 第49-50页 |
| ·昆明鼠保护力实验 | 第49-50页 |
| ·仔猪保护力实验 | 第50页 |
| ·建立ELISA方法测定感染血清与免疫血清 | 第50-51页 |
| ·ELISA最佳反应条件的选择 | 第50页 |
| ·ELISA具体操作步骤 | 第50页 |
| ·ELISA阴阳血清界限的确立 | 第50页 |
| ·分析特异性实验 | 第50-51页 |
| ·SsnA细胞免疫的检测 | 第51-52页 |
| ·小鼠脾淋巴细胞的制备 | 第51页 |
| ·实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-γ相对表达水平 | 第51-52页 |
| ·免疫小鼠脾淋巴细胞总RNA的提取 | 第51页 |
| ·cDNA的合成 | 第51页 |
| ·SYBR GreenI实时定量PCR | 第51-52页 |
| ·相对mRNA表达水平的计算 | 第52页 |
| ·猪链球菌35个血清型SsnA基因PCR扩增 | 第52页 |
| ·SsnA基因突变体质粒构建 | 第52-53页 |
| ·引物设计 | 第52页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第52页 |
| ·左臂和右臂的扩增 | 第52页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第52页 |
| ·PCR产物与pSET4s载体的连接 | 第52-53页 |
| ·感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第53页 |
| ·连接产物及质粒的转化 | 第53页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第53页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第53页 |
| 3 结果 | 第53-60页 |
| ·SsnA的克隆,连接和鉴定 | 第53-54页 |
| ·重组SsnA的表达及Western blot鉴定 | 第54-55页 |
| ·重组SsnA蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| ·重组SsnA蛋白的保护力效果测定 | 第56-57页 |
| ·ELISA方法的初步建立 | 第57-58页 |
| ·ELISA方法抗原最佳包被浓度和血清稀释浓度的确定 | 第57页 |
| ·ELISA方法最佳阴阳界定值的确立 | 第57页 |
| ·分析特异性实验 | 第57页 |
| ·ELISA方法检测感染血清与免疫血清 | 第57-58页 |
| ·实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 | 第58-59页 |
| ·35个血清型SsnA基因PCR扩增 | 第59页 |
| ·SsnA基因突变体质粒鉴定 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| ·SsnA的蛋白纯化 | 第60-61页 |
| ·分泌核酸酶A(SsnA)作为区分猪链球菌感染与免疫的指标 | 第61-62页 |
| 5 小结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
