| 摘要 | 第3-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 缩略词表 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-38页 |
| 1 原始生殖细胞 | 第19-24页 |
| 1.1 PGCs的生物学特性 | 第19页 |
| 1.2 PGCs的起源与迁移 | 第19-20页 |
| 1.3 PGCs的分离培养与体外诱导 | 第20-21页 |
| 1.4 PGCs形成的调控机制 | 第21-24页 |
| 1.4.1 细胞因子调控PGCs形成 | 第21-22页 |
| 1.4.1.1 视黄酸(RA) | 第21页 |
| 1.4.1.2 干细胞生长因子(SCF) | 第21-22页 |
| 1.4.1.3 白血病抑制因子(LIF) | 第22页 |
| 1.4.1.4 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) | 第22页 |
| 1.4.2 关键基因介导信号通路调控PGCs形成 | 第22-23页 |
| 1.4.2.1 SCF/c-kit信号通路 | 第22-23页 |
| 1.4.2.2 gp130信号通路 | 第23页 |
| 1.4.2.3 TGF-β/Smads信号通路 | 第23页 |
| 1.4.3 表观遗传对PGCs形成的调控 | 第23-24页 |
| 2 长链非编码RNA研究进展 | 第24-27页 |
| 2.1 长链非编码RNA概述 | 第24页 |
| 2.2 lncRNA的调控机制 | 第24-26页 |
| 2.2.1 转录调控 | 第24-25页 |
| 2.2.2 转录后调控 | 第25页 |
| 2.2.3 表观遗传学调控 | 第25-26页 |
| 2.2.3.1 lncRNA与DNA甲基化/去甲基化 | 第25-26页 |
| 2.2.3.2 lncRNA与组蛋白修饰 | 第26页 |
| 2.3 lncRNA与细胞分化 | 第26-27页 |
| 2.3.1 lncRNA与胚胎干细胞分化 | 第26页 |
| 2.3.2 lncRNA与生殖细胞分化 | 第26-27页 |
| 2.3.3 lncRNA与其他细胞分化 | 第27页 |
| 3 本研究的目的与意义 | 第27-28页 |
| 4 参考文献 | 第28-38页 |
| 第二章 lncRNA-M1ANCR的鉴定与理化性质分析 | 第38-51页 |
| 1 实验材料与方法 | 第38-44页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第38页 |
| 1.2 实验方法 | 第38-44页 |
| 1.2.1 Trizol法提取如皋黄鸡生殖嵴总RNA | 第38-39页 |
| 1.2.2 如皋黄鸡生殖嵴组织cDNA库的建立 | 第39页 |
| 1.2.3 lncRNA 3'RACE实验 | 第39-40页 |
| 1.2.4 lncRNA 5'RACE实验 | 第40-41页 |
| 1.2.5 鸡PGCs细胞分离与纯化 | 第41页 |
| 1.2.6 细胞定位检测 | 第41-43页 |
| 1.2.6.1 细胞核质分离 | 第42页 |
| 1.2.6.2 细胞核质RNA提取 | 第42-43页 |
| 1.2.7 lncRNA编码蛋白能力检测 | 第43-44页 |
| 1.2.7.1 原核融合表达载体的构建 | 第43页 |
| 1.2.7.2 菌液蛋白提取 | 第43页 |
| 1.2.7.3 Western Blot检测蛋白表达 | 第43-44页 |
| 2 实验结果 | 第44-49页 |
| 2.1 lncRNA-M1ANCR的筛选 | 第44-45页 |
| 2.2 RACE实验获得lncRNA-M1ANCR全长 | 第45-46页 |
| 2.3 lncRNA-M1ANCR序列生物信息学分析 | 第46页 |
| 2.3.1 lncRNA-M1ANCR ORF预测 | 第46页 |
| 2.3.2 lncRNA-M1ANCR同源性分析 | 第46页 |
| 2.4 lncRNA-MANCR在组织与细胞中的表达检测 | 第46-48页 |
| 2.5 lncRNA-M1ANCR蛋白编码能力的鉴定 | 第48-49页 |
| 3 讨论 | 第49页 |
| 4 本章小结 | 第49-50页 |
| 5 参考文献 | 第50-51页 |
| 第三章 lncRNA-M1ANCR在鸡PGCs生成过程中生物学功能探究 | 第51-74页 |
| 1 材料与方法 | 第51-57页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第51页 |
| 1.2 实验方法 | 第51-57页 |
| 1.2.1 lncRNA干扰载体构建及慢病毒包裹 | 第52页 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体活性检测 | 第52-53页 |
| 1.2.3 lncRNA过表达载体构建与活性检测 | 第53-54页 |
| 1.2.4 ESCs的分离培养 | 第54页 |
| 1.2.5 体外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能 | 第54-55页 |
| 1.2.5.1 鸡ESCs体外诱导分化试验 | 第54页 |
| 1.2.5.2 实时荧光定量PCR检测生殖相关基因的表达 | 第54-55页 |
| 1.2.5.3 免疫细胞化学检测相关抗原 | 第55页 |
| 1.2.5.4 流式细胞分析检测类PGCs细胞比例 | 第55页 |
| 1.2.6 体内研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能 | 第55-57页 |
| 1.2.6.1 鸡胚血管注射与活体荧光观察 | 第56页 |
| 1.2.6.2 实时荧光定量PCRs检测生殖相关基因的表达 | 第56页 |
| 1.2.6.3 鸡胚石蜡切片 | 第56-57页 |
| 1.2.6.4 PAS染色法检测PGCs | 第57页 |
| 1.2.6.5 流式细胞分析检测PGCs细胞比例 | 第57页 |
| 2 实验结果 | 第57-70页 |
| 2.1 lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体的构建与活性检测 | 第57-60页 |
| 2.1.1 干扰载体构建 | 第57-58页 |
| 2.1.2 干扰载体活性检测 | 第58-60页 |
| 2.2 lncRNA-M1ANCR过表达载体的构建与活性检测 | 第60-62页 |
| 2.2.1 lncRNA-M1ANCR过表达载体的构建 | 第60-61页 |
| 2.2.2 lncRNA-M1ANCR过表达载体活性检测 | 第61-62页 |
| 2.3 体外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能 | 第62-67页 |
| 2.3.1 不同lncRNA-M1ANCR表达水平下PGCs形成过程中细胞形态变化 | 第62-63页 |
| 2.3.2 不同lncRNA-M1ANCR表达水平下生殖标记基因的表达变化 | 第63-64页 |
| 2.3.3 细胞免疫化学检测相关抗原 | 第64-66页 |
| 2.3.4 流式细胞分析检测类PGCs样细胞比例 | 第66-67页 |
| 2.4 体内研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能 | 第67-70页 |
| 2.4.1 鸡胚石蜡切片观察及PAS染色 | 第67-68页 |
| 2.4.2 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 | 第68-69页 |
| 2.4.3 流式细胞分析检测PGCs细胞比例 | 第69-70页 |
| 3 讨论 | 第70-71页 |
| 4 本章小结 | 第71页 |
| 5 参考文献 | 第71-74页 |
| 第四章 启动子对lncRNA-M1ANCR表达的影响 | 第74-88页 |
| 1 实验材料与方法 | 第74-79页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第74页 |
| 1.2 实验方法 | 第74-79页 |
| 1.2.1 lncRNA启动子区域的生物信息学分析 | 第74-75页 |
| 1.2.2 鸡胚全基因组的提取 | 第75页 |
| 1.2.3 真核表达载体pM1ANCR-EGFP与启动子各缺失片段载体的构建 | 第75-77页 |
| 1.2.3.1 lncRNA-M1ANCR启动子区域真核表达载体构建 | 第75-76页 |
| 1.2.3.2 启动子各缺失片段载体的构建 | 第76-77页 |
| 1.2.4 lncRNA启动子活性定性分析 | 第77页 |
| 1.2.4.1 pM1ANCR-EGFP质粒的提取 | 第77页 |
| 1.2.4.2 pM1ANCR-EGFP质粒转染 | 第77页 |
| 1.2.5 lncRNA启动子核心区域的鉴定 | 第77-78页 |
| 1.2.6 lncRNA启动子核心区域转录因子分析 | 第78页 |
| 1.2.7 转录因子p53干扰载体与过表达载体的构建 | 第78页 |
| 1.2.8 转录因子反式调控的启动子活性检测 | 第78-79页 |
| 2 实验结果 | 第79-85页 |
| 2.1 真核表达载体pM1ANCR-EGFP与启动子各缺失片段载体的构建 | 第79-80页 |
| 2.2 lncRNA启动子活性定性分析 | 第80页 |
| 2.3 lncRNA启动子核心区域分析 | 第80-81页 |
| 2.4 p53基因干扰载体与过表达载体的构建与活性检测 | 第81-84页 |
| 2.5 转录因子p53对启动子活性的影响 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| 4 本章小结 | 第86页 |
| 5 参考文献 | 第86-88页 |
| 第五章 lncRNA-M1ANCR影响PGCs形成的分子机制初探 | 第88-115页 |
| 1 实验材料与方法 | 第88-97页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第88-89页 |
| 1.2 实验方法 | 第89-97页 |
| 1.2.1 RNA pull down筛选鉴定互作蛋白 | 第89-92页 |
| 1.2.1.1 RNA pulldown筛选lncRNA互作蛋白 | 第89-91页 |
| 1.2.1.2 RIP实验 | 第91-92页 |
| 1.2.2 lncRNA互作miRNA分析 | 第92页 |
| 1.2.3 miRNA抑制物的构建 | 第92-93页 |
| 1.2.3.1 miRNA-lnhibitor引物的设计 | 第92页 |
| 1.2.3.2 miRNA-lnhibitor慢病毒重组质粒的构建 | 第92-93页 |
| 1.2.4 miRNA模拟物的构建 | 第93-95页 |
| 1.2.4.1 pri- miR引物的设计 | 第93-94页 |
| 1.2.4.2 pri-miR病毒重组质粒的构建 | 第94-95页 |
| 1.2.4.2.1 载体的双酶切 | 第94页 |
| 1.2.4.2.2 目的片段的扩增及酶切 | 第94页 |
| 1.2.4.2.3 过表达载体与目的片段的连接 | 第94-95页 |
| 1.2.4.2.4 转化 | 第95页 |
| 1.2.4.2.5 测序 | 第95页 |
| 1.2.5 鸡ESCs体外诱导实验 | 第95页 |
| 1.2.6 microRNA的提取 | 第95-96页 |
| 1.2.6.1 组织裂解 | 第95页 |
| 1.2.6.2 分离小RNA | 第95-96页 |
| 1.2.6.3 miRNA的分离纯化 | 第96页 |
| 1.2.7 miRNA qRT-PCR引物合成与SYBR GREEN I实时荧光定量PCR | 第96页 |
| 1.2.8 实时荧光定量检测MAPK/ERK和Wnt信号通路关键基因表达 | 第96-97页 |
| 1.2.9 流式细胞分析检测类PGCs细胞比例 | 第97页 |
| 2 实验结果 | 第97-111页 |
| 2.1 基于RNA pull down技术筛选lncRNA-M1ANCR互作蛋白 | 第97-100页 |
| 2.1.1 RNA pull down结果分析筛选互作蛋白 | 第97-99页 |
| 2.1.2 Western Blot检测与RIP实验确定lncRNA-M1ANCR与ILF3存在互作 | 第99-100页 |
| 2.2 lncRNA-M1ANCR与miRNA竞争性结合抑制机制初探 | 第100-110页 |
| 2.2.1 分析预测与lncRNA及靶基因存在互作关系的microRNA | 第100页 |
| 2.2.2 microRNA模拟物与抑制物的构建与活性检测 | 第100-103页 |
| 2.2.2.1 microRNA模拟物与抑制物的构建 | 第100-101页 |
| 2.2.2.2 microRNA模拟物与抑制物的活性检测 | 第101-103页 |
| 2.2.3 体外研究miRNA在PGCs形成过程中的功能 | 第103-105页 |
| 2.2.3.1 不同miRNA表达水平下PGCs形成过程中细胞形态变化 | 第103-104页 |
| 2.2.3.2 不同miRNA表达水平下下MAPK1、lncRNA-M1ANCR和生殖标记基因动态变化 | 第104-105页 |
| 2.2.4 流式细胞分析检测类PGCs样细胞数量 | 第105-109页 |
| 2.2.5 拯救实验 | 第109-110页 |
| 2.3 实时荧光定量检测MAPK信号通路关键基因表达变化 | 第110-111页 |
| 3 讨论 | 第111-113页 |
| 4 本章小结 | 第113页 |
| 5 参考文献 | 第113-115页 |
| 全文结论与创新 | 第115-117页 |
| 全文结论 | 第115页 |
| 全文创新点 | 第115-117页 |
| 致谢 | 第117-119页 |
| 附录 | 第119-121页 |
| 研究生期间发表的论文 | 第121-123页 |
