| 符号说明 | 第4-8页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 维生素K环氧化物还原酶的研究进展 | 第12-16页 |
| 1.1.1 原核生物维生素K环氧化物还原酶的研究 | 第12-13页 |
| 1.1.2 大肠杆菌内Dsb系统的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1.3 植物维生素K环氧化物还原酶的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.1.4 植物中叶绿醌的作用 | 第16页 |
| 1.2 分子对接 | 第16-18页 |
| 1.2.1 受体结构分子的准备 | 第17页 |
| 1.2.2 分子对接运算 | 第17页 |
| 1.2.3 分子对接的评价 | 第17-18页 |
| 1.3 定点突变技术用于蛋白质功能的研究 | 第18页 |
| 1.4 二硫键形成功能的研究方法与原理 | 第18-19页 |
| 1.5 抗逆功能基因研究的必要性 | 第19-21页 |
| 1.5.1 植物对非生物胁迫的应答机制 | 第19-20页 |
| 1.5.2 抗盐植株培育的必要性 | 第20页 |
| 1.5.3 干旱胁迫对植物生长的影响 | 第20-21页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第22-23页 |
| 2.1.2 工具酶与各种生化试剂 | 第23页 |
| 2.1.3 主要实验仪器 | 第23-24页 |
| 2.2 主要试剂的配制 | 第24-26页 |
| 2.2.1 实验所用溶液的配制 | 第24-25页 |
| 2.2.1.1 酵母转化所用试剂 | 第24页 |
| 2.2.1.2 AtVKOR二硫键形成功能分析相关试剂的配制 | 第24-25页 |
| 2.2.1.3 高效液相色谱流动相的配制 | 第25页 |
| 2.2.1.4 Tss转化法相关试剂的配制 | 第25页 |
| 2.2.2 培养基的配制 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 LB培养基 | 第25页 |
| 2.2.2.2 各种胁迫LB培养基的配制 | 第25-26页 |
| 2.2.2.3 5×M63培养基储存液的配制 | 第26页 |
| 2.2.2.4 M63培养基 | 第26页 |
| 2.2.2.5 YNB培养基和SD-Ura培养基 | 第26页 |
| 2.2.2.6 YPDA培养基 | 第26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.3.1 分子对接 | 第26-27页 |
| 2.3.1.1 拟南芥VKOR三维结构的确定及小分子叶绿醌结构的准备 | 第26-27页 |
| 2.3.1.2 分子对接 | 第27页 |
| 2.3.2 拟南芥AtVKOR基因真核表达载体pYWT的构建 | 第27-33页 |
| 2.3.2.1 AtVKOR基因的扩增、克隆及序列测定 | 第27-31页 |
| 2.3.2.2 真核表达载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.4 膜蛋白VKOR粗酶液制备 | 第33页 |
| 2.5 AtVKOR蛋白还原酶活性的检测 | 第33-34页 |
| 2.6 叶绿醌与相应的对苯二酚的HPLC方法检测,及对苯二酚浓度与峰面积测定 | 第34页 |
| 2.7 定点突变 | 第34页 |
| 2.8 VKOR基因在抗逆功能的研究 | 第34-37页 |
| 2.8.1 大肠杆菌生长状况的差别研究 | 第34页 |
| 2.8.2 植物材料RNA提取和荧光定量PCR | 第34-35页 |
| 2.8.2.1 番茄植株总RNA提取 | 第34-35页 |
| 2.8.2.2 反转录cDNA与荧光定量PCR | 第35页 |
| 2.8.3 DAB和NBT染色 | 第35页 |
| 2.8.4 抗氧化物酶活性测定 | 第35-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-55页 |
| 3.1 AtVKOR真核表达体系的构建及还原醌活性的检测 | 第37-38页 |
| 3.1.1 真核表达载体pYWT的构建 | 第37-38页 |
| 3.1.2 野生型拟南芥VKOR还原叶绿醌活性的检测 | 第38页 |
| 3.2 分子对接预测拟南芥VKOR结合叶绿醌活性中的关键氨基酸残基 | 第38-40页 |
| 3.3 醌结合位点氨基酸残基直接参与AtVKOR催化醌还原的活性 | 第40-42页 |
| 3.3.1 各个突变体真核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.2 各个突变体还原叶绿醌活性的检测 | 第41-42页 |
| 3.4 醌结合位点氨基酸残基与氧化底物蛋白二硫键形成有关 | 第42-45页 |
| 3.4.1 原核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 3.4.2 大肠杆菌运动弥补性实验检测突变体二硫键的形成 | 第43-44页 |
| 3.4.3 β-半乳糖苷酶活性检测突变体二硫键的形成 | 第44-45页 |
| 3.5 VKOR结构域中的半胱氨酸残基与VKOR还原叶绿醌活性直接相关 | 第45-47页 |
| 3.5.1 拟南芥VKOR结构域上半胱氨酸突变体的真核表达载体的构建和鉴定 | 第45-46页 |
| 3.5.2 拟南芥VKOR结构域半胱氨酸突变体质粒转化酵母菌BY4741 | 第46页 |
| 3.5.3 拟南芥VKOR结构域必需半胱氨酸还原醌活性的检测 | 第46-47页 |
| 3.6 番茄VKOR抗逆功能的研究 | 第47-55页 |
| 3.6.1 重组表达的番茄VKOR(SlVKOR)可以提高原核细胞抵抗渗透胁迫的能力 | 第47-50页 |
| 3.6.2 渗透胁迫诱导SlVKOR的表达 | 第50页 |
| 3.6.3 SlVKOR的不同表达水平影响了植株对渗透胁迫的抵抗能力 | 第50-51页 |
| 3.6.4 SlVKOR的不同表达水平影响了植株体内ROS的积累量 | 第51-52页 |
| 3.6.5 SlVKOR不同表达水平植株中活性氧清除酶类活性分析 | 第52-55页 |
| 4 讨论 | 第55-59页 |
| 5 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 附录 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第68页 |
