| 英文縮略词及中文对照表 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 引言 | 第12-25页 |
| 1.1 纤维素的研究概况 | 第12-13页 |
| 1.2 纤维素酶研究进展 | 第13-19页 |
| 1.3 分子改造的应用 | 第19-21页 |
| 1.4 纤维素酶的定向进化 | 第21-23页 |
| 1.5 选题目的意义、研究内容、技术路线 | 第23-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-38页 |
| 2.1 材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 供试菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.3 相关试剂 | 第25页 |
| 2.1.4 仪器 | 第25页 |
| 2.1.5 溶液配制 | 第25-27页 |
| 2.1.6 培养基 | 第27-28页 |
| 2.2 基因克隆 | 第28-30页 |
| 2.2.1 eg1基因的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.2 PCR产物回收 | 第29页 |
| 2.2.3 测序载体构建 | 第29页 |
| 2.2.4 转化大肠杆菌 | 第29页 |
| 2.2.5 菌落PCR检测和质粒DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.5.1 菌落PCR检测 | 第29页 |
| 2.2.5.2 质粒DNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.5.3 序列测定 | 第29-30页 |
| 2.3 eg1基因在毕赤酵母中的表达和性质研究 | 第30-34页 |
| 2.3.1 eg1基因酵母表达载体的构建 | 第30页 |
| 2.3.2 线性化以及去磷酸化 | 第30-31页 |
| 2.3.3 酵母转化 | 第31页 |
| 2.3.3.1 制备毕赤酵母GS115 | 第31页 |
| 2.3.3.2 重组质粒pPIC9K/eg1转化GS115 | 第31页 |
| 2.3.4 转化子的筛选 | 第31-32页 |
| 2.3.4.1 甲醇利用表型筛选 | 第31-32页 |
| 2.3.4.2 G418平板筛选 | 第32页 |
| 2.3.5 转化子PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 2.3.6 eg1基因诱导分泌表达 | 第33页 |
| 2.3.7 eg1工程菌蛋白纯化及酶学性质 | 第33-34页 |
| 2.3.7.1 制备发酵液 | 第33页 |
| 2.3.7.2 硫酸铵沉淀 | 第33页 |
| 2.3.7.3 DEAE-SepHarose阴离子交换柱层析 | 第33页 |
| 2.3.7.4 酶活力测定 | 第33页 |
| 2.3.7.5 纯化产物SDS-PAGE分析 | 第33-34页 |
| 2.3.7.6 蛋白质含量测定 | 第34页 |
| 2.4 嗜热真菌内切纤维素酶eg1的定向进化 | 第34-38页 |
| 2.4.1 易错PCR | 第34页 |
| 2.4.2 易错PCR产物回收 | 第34页 |
| 2.4.3 易错PCR产物酶切及纯化 | 第34-35页 |
| 2.4.3.1 易错PCR产物酶切 | 第34-35页 |
| 2.4.3.2 易错PCR酶切产物纯化 | 第35页 |
| 2.4.4 表达载体pPIC9K的酶切纯化 | 第35页 |
| 2.4.4.1 表达载体pPIC9K的双酶切 | 第35页 |
| 2.4.4.2 表达载体pPIC9K酶切产物纯化 | 第35页 |
| 2.4.5 构建突变体库 | 第35-36页 |
| 2.4.5.1 易错PCR产物与pPIC9K的连接 | 第35页 |
| 2.4.5.2 转化DH5α | 第35页 |
| 2.4.5.3 提取质粒 | 第35页 |
| 2.4.5.4 质粒线性化和去磷酸化 | 第35-36页 |
| 2.4.6 酵母转化 | 第36页 |
| 2.4.7 突变体库的筛选 | 第36-37页 |
| 2.4.7.1 刚果红底物平板筛选 | 第36页 |
| 2.4.7.2 G418平板筛选 | 第36页 |
| 2.4.7.3 小量发酵 | 第36页 |
| 2.4.7.4 突变基因序列测定 | 第36页 |
| 2.4.7.5 大量发酵 | 第36-37页 |
| 2.4.8 eg1工程菌表达产物的纯化和酶学性质 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-56页 |
| 3.1 eg1基因成熟肽序列的克隆 | 第38-39页 |
| 3.2 eg1基因测序结果分析 | 第39-40页 |
| 3.2.1 eg1基因测序结果 | 第39-40页 |
| 3.2.2 eg1基因的核苷酸序列分析 | 第40页 |
| 3.2.3 eg1基因氨基酸序列分析 | 第40页 |
| 3.3 内切葡聚糖酶eg1在酵母中的表达 | 第40-42页 |
| 3.4 电击转酵母和转化子的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4.1 甲醇利用表型筛选 | 第42页 |
| 3.4.2 eg1基因G418多拷贝平板筛选 | 第42页 |
| 3.4.3 转化子PCR验证 | 第42-43页 |
| 3.5 内切葡聚糖酶eg1的诱导表达及产物的检测 | 第43-44页 |
| 3.6 表达内切葡聚糖酶eg1的纯化及酶学性质 | 第44-47页 |
| 3.6.1 GpN25工程菌的纯化 | 第44页 |
| 3.6.2 GpN25工程菌的性质测定 | 第44-47页 |
| 3.6.2.1 GpN25工程菌最适温度 | 第44-45页 |
| 3.6.2.2 GpN25工程菌最适pH | 第45-46页 |
| 3.6.2.3 GpN25工程菌不同底物酶活力测定 | 第46页 |
| 3.6.2.4 GpN25工程菌热稳定性 | 第46-47页 |
| 3.7 嗜热真菌内切纤维素酶eg1的定向进化 | 第47-56页 |
| 3.7.1 易错PCR | 第47页 |
| 3.7.2 突变基因的筛选 | 第47-49页 |
| 3.7.2.1 刚果红底物平板初筛 | 第47-48页 |
| 3.7.2.2 G418平板筛选 | 第48页 |
| 3.7.2.3 小量发酵筛选 | 第48页 |
| 3.7.2.4 大量发酵筛选 | 第48-49页 |
| 3.7.3 突变体NT0252和NT0253蛋白的纯化 | 第49-50页 |
| 3.7.3.1 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析 | 第49页 |
| 3.7.3.2 突变体NT0252和NT0253的SDS-PAGE分析 | 第49-50页 |
| 3.7.4 突变体NT0252和NT0253的性质测定 | 第50-53页 |
| 3.7.4.1 NT0252和NT0253的最适温度 | 第50-51页 |
| 3.7.4.2 NT0252和NT0253的最适pH | 第51页 |
| 3.7.4.3 NT0252和NT0253的最适底物 | 第51-52页 |
| 3.7.4.4 NT0252和NT0253的热稳定性 | 第52-53页 |
| 3.7.5 突变体NT0252和NT0253的序列测定 | 第53-56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 4.1 突变体库的构建 | 第56页 |
| 4.2 突变体的筛选 | 第56-57页 |
| 4.3 突变体活性提高的机制 | 第57-58页 |
| 5 结论和建议 | 第58-60页 |
| 5.1 结论 | 第58页 |
| 5.1.1 内切葡聚糖酶eg1的表达和性质研究 | 第58页 |
| 5.1.2 内切葡聚糖酶eg1基因的定向进化 | 第58页 |
| 5.2 建议 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
