| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 常用词语缩写 | 第7-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-19页 |
| 1 IL-10的发现 | 第13页 |
| 2 IL-10家族概述 | 第13-14页 |
| 3 IL-10的来源及生物学特性 | 第14-15页 |
| 3.1 IL-10的来源 | 第14页 |
| 3.2 IL-10的基本特征 | 第14-15页 |
| 3.3 IL-10的生物学功能 | 第15页 |
| 4 IL-10的研究进展 | 第15-18页 |
| 4.1 IL-10与疾病 | 第15-17页 |
| 4.1.1 IL-10与感染性疾病 | 第15-16页 |
| 4.1.2 IL-10与自身免疫疾病 | 第16-17页 |
| 4.1.3 IL-10与移植排斥 | 第17页 |
| 4.2 IL-10基因多态性的研究 | 第17-18页 |
| 5 本研究的主要内容及目的意义 | 第18-19页 |
| 5.1 研究的主要内容 | 第18页 |
| 5.2 研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 兔IL-10基因编码区克隆及生物信息学分析 | 第19-36页 |
| 1 材料与试剂 | 第19-21页 |
| 1.1 实验材料 | 第19页 |
| 1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 1.3 其它主要试剂的配制 | 第19-20页 |
| 1.3.1 细菌培养基 | 第19页 |
| 1.3.2 抗生素 | 第19-20页 |
| 1.3.3 碱裂解法质粒提取液 | 第20页 |
| 1.3.4 电泳缓冲液 | 第20页 |
| 1.4 主要的仪器设备 | 第20-21页 |
| 2 实验方法 | 第21-25页 |
| 2.1 IL-10基因的克隆及pMD19-T-IL-10载体构建 | 第21-24页 |
| 2.1.1 脾脏组织总RNA的提取 | 第21页 |
| 2.1.2 引物设计 | 第21-22页 |
| 2.1.3 IL-10基因cDNA的合成及扩增 | 第22页 |
| 2.1.4 PCR产物的回收与纯化 | 第22页 |
| 2.1.5 IL-10基因的T-A克隆 | 第22-23页 |
| 2.1.6 质粒的转化 | 第23页 |
| 2.1.7 菌液PCR鉴定 | 第23页 |
| 2.1.8 质粒的提取(碱裂解法) | 第23-24页 |
| 2.1.9 质粒的酶切鉴定 | 第24页 |
| 2.2 IL-10基因的生物信息学分析 | 第24-25页 |
| 2.2.1 GenBank中的BLAST工具 | 第24页 |
| 2.2.2 生物软件网的SMS在线工具 | 第24页 |
| 2.2.3 蛋白理化性质分析 | 第24-25页 |
| 2.2.4 疏水性分析 | 第25页 |
| 2.2.5 二硫键预测 | 第25页 |
| 2.2.6 信号肽预测 | 第25页 |
| 2.2.7 跨膜结构预测 | 第25页 |
| 2.2.8 亚细胞定位预测 | 第25页 |
| 2.2.9 O-糖基化位点预测 | 第25页 |
| 2.2.10 N-糖基化位点预测 | 第25页 |
| 2.2.11 磷酸化位点预测 | 第25页 |
| 2.2.12 蛋白质二级结构预测 | 第25页 |
| 2.2.13 蛋白质高级结构预测 | 第25页 |
| 2.2.14 采用MEGA4.1软件 | 第25页 |
| 3 结果与分析 | 第25-33页 |
| 3.1 IL-10基因的克隆及pMD19-T-IL-10载体构建 | 第25-27页 |
| 3.1.1 IL-10 基因的克隆 | 第25-26页 |
| 3.1.2 pMD19-T-IL-10载体的鉴定 | 第26-27页 |
| 3.2 IL-10基因的生物信息学分析 | 第27-33页 |
| 3.2.1 IL-10基因的序列 | 第27-28页 |
| 3.2.2 IL-10的功能位点分析 | 第28页 |
| 3.2.3 IL-10蛋白理化性质分析 | 第28页 |
| 3.2.4 疏水性分析 | 第28-29页 |
| 3.2.5 信号肽、二硫键及跨膜区结构分析 | 第29-30页 |
| 3.2.6 亚细胞定位分析 | 第30页 |
| 3.2.7 糖基化与磷酸化位点分析 | 第30-31页 |
| 3.2.8 蛋白质二级结构预测 | 第31-32页 |
| 3.2.9 蛋白质高级结构预测 | 第32页 |
| 3.2.10 IL-10氨基酸序列同源性分析 | 第32-33页 |
| 3.2.11 IL-10进化树的构建 | 第33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 5 结论 | 第35-36页 |
| 第三章 兔IL-10基因外显子多态性分析 | 第36-44页 |
| 1 材料与试剂 | 第36-37页 |
| 1.1 实验材料 | 第36页 |
| 1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 1.3 其他主要试剂的配制 | 第36-37页 |
| 1.4 主要的仪器设备 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-39页 |
| 2.1 基因组DNA提取 | 第37-38页 |
| 2.2 引物设计 | 第38页 |
| 2.3 PCR扩增 | 第38页 |
| 2.4 PCR-SSCP检测 | 第38-39页 |
| 2.5 序列分析 | 第39页 |
| 2.6 基因和基因型频率的测算 | 第39页 |
| 2.7 多态信息含量(Polymrphism Information Content,PIC) | 第39页 |
| 2.8 ELISA法检测血清中IL-10指标 | 第39页 |
| 2.9 数据分析 | 第39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-41页 |
| 3.1 PCR-SSCP检测结果 | 第39-40页 |
| 3.2 序列分析 | 第40页 |
| 3.3 不同群体外显子3遗传多样性分析 | 第40-41页 |
| 3.4 不同群体外显子3多态性与免疫指标IL-10的关联性分析 | 第41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| 5 结论 | 第43-44页 |
| 第四章 兔IL-10基因的原核表达及抗体制备 | 第44-55页 |
| 1 材料与试剂 | 第44-46页 |
| 1.1 实验材料 | 第44页 |
| 1.2 主要试剂 | 第44页 |
| 1.3 其它主要试剂的配制 | 第44-45页 |
| 1.3.1 SDS-PAGE相关溶液 | 第44-45页 |
| 1.3.2 His亲和层析纯化试剂 | 第45页 |
| 1.3.3 Western blot相关溶液 | 第45页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第45-46页 |
| 2 实验方法 | 第46-50页 |
| 2.1 重组质粒pET-IL-10的构建 | 第46页 |
| 2.2 大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 | 第46-47页 |
| 2.3 抗原的制备和纯化 | 第47-48页 |
| 2.3.1 包涵体的溶解 | 第47页 |
| 2.3.2 融合蛋白的Ni柱纯化 | 第47-48页 |
| 2.4 免疫动物 | 第48页 |
| 2.5 多克隆抗血清的制备 | 第48页 |
| 2.6 多克隆抗体效价和特异性检测 | 第48-50页 |
| 2.6.1 间接ELISA检测抗体效价 | 第48-49页 |
| 2.6.2 Western blot检测抗体特异性 | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-52页 |
| 3.1 重组质粒pET-IL-10的构建 | 第50-51页 |
| 3.2 SDS-PAGE分析重组蛋白 | 第51-52页 |
| 3.3 重组蛋白的免疫印迹分析 | 第52页 |
| 3.3.1 抗体效价的检测 | 第52页 |
| 3.3.2 抗体的Western blot检测 | 第52页 |
| 4 讨论 | 第52-53页 |
| 5 结论 | 第53-55页 |
| 第五章 兔IL-10基因的真核表达及亚细胞定位 | 第55-63页 |
| 1 材料与试剂 | 第55-56页 |
| 1.1 实验材料 | 第55页 |
| 1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 1.3 其它主要试剂的配制 | 第55-56页 |
| 1.4 主要的仪器设备 | 第56页 |
| 2 实验方法 | 第56-58页 |
| 2.1 引物设计 | 第56页 |
| 2.2 重组质粒pEGFP-IL-10的构建 | 第56页 |
| 2.3 细胞培养及传代 | 第56-57页 |
| 2.3.1 细胞培养 | 第56页 |
| 2.3.2 细胞传代 | 第56-57页 |
| 2.4 重组质粒pEGFP-IL-10转染DF-1细胞 | 第57-58页 |
| 2.5 目的基因在DF-1细胞中的mRNA表达检测 | 第58页 |
| 2.6 目的基因在DF-1细胞中的蛋白表达检测 | 第58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-61页 |
| 3.1 重组质粒pET-IL-10的构建 | 第58-59页 |
| 3.2 重组质粒pEGFP-IL-10转染DF-1细胞的检测结果 | 第59-60页 |
| 3.3 RT-PCR检测细胞中基因的表达 | 第60页 |
| 3.4 WB检测细胞中蛋白的表达 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-62页 |
| 5 结论 | 第62-63页 |
| 第六章 全文结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录 | 第72-73页 |
