| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-24页 |
| 1.1 谢瓦氏曲霉间型变种简介 | 第12-13页 |
| 1.2 丝状真菌遗传转化的概述 | 第13-15页 |
| 1.2.1 选择标记 | 第14页 |
| 1.2.2 转化方法 | 第14-15页 |
| 1.3 DNA双链断裂的修复机制 | 第15-20页 |
| 1.3.1 同源重组 | 第16页 |
| 1.3.2 非同源末端交联 | 第16-18页 |
| 1.3.3 HR与NHEJ的关系 | 第18-19页 |
| 1.3.4 Ku蛋白 | 第19-20页 |
| 1.4 提高丝状真菌基因敲除效率的策略 | 第20-22页 |
| 1.4.1 常规方法 | 第20页 |
| 1.4.2 split-maker技术 | 第20-21页 |
| 1.4.3 正/负双向筛选体系 | 第21页 |
| 1.4.4 抑制NHEJ途径 | 第21-22页 |
| 1.5 ku70基因敲除突变菌株的特性 | 第22-23页 |
| 1.6 研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 构建双元载体pDHt/sknt及转化谢瓦氏曲霉间型变种 | 第24-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.3 培养基 | 第25-26页 |
| 2.1.4 仪器 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-30页 |
| 2.2.1 常规实验方法 | 第26-28页 |
| 2.2.1.1 质粒DNA提取 | 第26页 |
| 2.2.1.2 谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.1.3 DNA的体外重组操作 | 第27页 |
| 2.2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第27页 |
| 2.2.1.5 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第27-28页 |
| 2.2.1.6 根癌农杆菌转化子的验证 | 第28页 |
| 2.2.1.7 分生孢子的制备 | 第28页 |
| 2.2.1.8 根癌农杆菌介导的谢瓦氏曲霉间型变种遗传转化 | 第28页 |
| 2.2.2 谢瓦氏曲霉间型变种对G418敏感性的测定 | 第28-29页 |
| 2.2.3 双元载体pDHt/sknt的构建及转化根癌农杆菌 | 第29页 |
| 2.2.4 谢瓦氏曲霉间型变种转化子的验证 | 第29-30页 |
| 2.2.4.1 转化子的PCR验证 | 第29页 |
| 2.2.4.2 转化子的遗传稳定性验证 | 第29-30页 |
| 2.2.4.3 转化子的southern blot验证 | 第30页 |
| 2.3 结果与分析 | 第30-33页 |
| 2.3.1 谢瓦氏曲霉间型变种对G418的敏感性 | 第30-31页 |
| 2.3.2 双元载体pDHt/sknt的构建及转化根癌农杆菌 | 第31-32页 |
| 2.3.3 谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化 | 第32-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-35页 |
| 2.4.1 选用G418抗性选择标记 | 第33-34页 |
| 2.4.2 通过中间质粒构建了双元载体pDHt/sknt | 第34页 |
| 2.4.3 谢瓦氏曲霉间型变种nptⅡ转化子遗传稳定 | 第34-35页 |
| 2.4.4 双元载体pDHt/sknt可以用于其它丝状真菌的遗传转化 | 第35页 |
| 2.5 小结 | 第35-36页 |
| 3 ku70基因敲除突变菌株的构建及功能分析 | 第36-51页 |
| 3.1 实验材料 | 第36-38页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 3.1.3 培养基 | 第36页 |
| 3.1.4 仪器 | 第36-38页 |
| 3.2 实验方法 | 第38-43页 |
| 3.2.1 常规实验方法 | 第38-39页 |
| 3.2.1.1 谢瓦氏曲霉间型变种的菌落PCR | 第38页 |
| 3.2.1.2 根癌农杆菌介导的基因敲除 | 第38页 |
| 3.1.1.3 单孢分离 | 第38-39页 |
| 3.1.1.4 其他实验方法 | 第39页 |
| 3.2.2 ku70基因的克隆 | 第39页 |
| 3.2.3 veA基因敲除载体的构建及转化根癌农杆菌 | 第39-41页 |
| 3.2.4 ku70基因敲除突变菌株的构建 | 第41-42页 |
| 3.2.5 Ku70基因敲除突变菌株Δku70的表型观察 | 第42页 |
| 3.2.6 基因敲除效率的分析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-49页 |
| 3.3.1 ku70基因的克隆与注释 | 第43-44页 |
| 3.3.2 veA基因敲除载体的构建及转化根癌农杆菌 | 第44-45页 |
| 3.3.3 ku70基因敲除突变菌株的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.4 ku70基因敲除突变菌株表型观察 | 第46-47页 |
| 3.3.5 基因敲除效率的分析 | 第47-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-50页 |
| 3.4.1 选用veA和flbA基因分析基因敲除效率 | 第49页 |
| 3.4.2 ku70基因敲除突变菌株表型 | 第49-50页 |
| 3.4.3 基因敲除的效率 | 第50页 |
| 3.5 小结 | 第50-51页 |
| 4 总结 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 附录 | 第60页 |
