| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 符号与缩略语说明 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-43页 |
| 1 取代脲类除草剂的种类及其应用 | 第17-18页 |
| 1.1 取代脲类除草剂的种类 | 第17-18页 |
| 1.2 取代脲类除草剂在农业生产中的应用 | 第18页 |
| 2 取代脲类除草剂对环境的危害 | 第18-22页 |
| 2.1 取代脲类除草剂的环境行为 | 第18-21页 |
| 2.2 取代脲类除草剂的毒性和危害 | 第21-22页 |
| 3 取代脲类除草剂的微生物降解菌株的筛选 | 第22-26页 |
| 3.1 能够降解取代脲类除草剂的细菌 | 第22-25页 |
| 3.2 能够降解取代脲类除草剂的真菌 | 第25-26页 |
| 4 微生物降解取代脲除草剂的降解途径 | 第26-32页 |
| 4.1 异丙隆微生物代谢的途径 | 第27-28页 |
| 4.2 敌草隆微生物代谢的途径 | 第28-30页 |
| 4.3 利谷隆微生物代谢的途径 | 第30-32页 |
| 5 降解取代脲类除草剂的基因及其酶 | 第32-33页 |
| 6 取代脲除草剂微生物降解存在的问题及本研究的意义 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-43页 |
| 第二部分 实验部分 | 第43-149页 |
| 第一章 降解菌株Sphingobium sp.YBL2中脱甲基酶基因的克隆及其功能验证 | 第43-97页 |
| 1 材料与方法 | 第43-59页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第43-44页 |
| 1.2 菌株和质粒 | 第44-45页 |
| 1.3 菌株的培养条件 | 第45页 |
| 1.4 转座子随机插入突变建库 | 第45页 |
| 1.5 异丙隆降解失活突变株的筛选 | 第45-46页 |
| 1.6 突变株降解种子液的制备和降解能力的验证 | 第46页 |
| 1.7 菌株基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 1.8 插入位点上下游序列的PCR扩增 | 第47-49页 |
| 1.9 序列拼接测序 | 第49页 |
| 1.10 DNA序列分析 | 第49页 |
| 1.11 加氧酶大亚基基因pdmA的敲除 33 | 第49-51页 |
| 1.12 功能互补 | 第51-52页 |
| 1.13 脱甲基酶在不同宿主中的表达 | 第52-53页 |
| 1.14 加氧酶系统发育树分析 | 第53页 |
| 1.15 铁氧化还原蛋白与PdmAB在大肠杆菌中的共表达 | 第53-56页 |
| 1.16 E. coli BL21(DE3)(pETAB/pBBR341)对其它取代脲类除草剂的降解 | 第56-58页 |
| 1.17 其它异丙隆降解菌株中脱甲基酶基因的扩增 | 第58-59页 |
| 1.18 取代脲类除草剂及其代谢产物的检测 | 第59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-86页 |
| 2.1 二亲结合最优条件的摸索 | 第59页 |
| 2.2 突变株的表型分析 | 第59-60页 |
| 2.3 SEFA-PCR克隆突变基因 | 第60页 |
| 2.4 克隆基因的组装与分析 | 第60-64页 |
| 2.5 大亚基pdmA的敲除 | 第64-65页 |
| 2.6 YBL2-DA降解特性的研究 | 第65-66页 |
| 2.7 回补实验 | 第66-68页 |
| 2.8 PdmAB的异源表达 | 第68-73页 |
| 2.9 加氧酶系统发育分析 | 第73-75页 |
| 2.10 共表达铁氧化还原蛋白能显著的提高PdmAB的活性 | 第75-78页 |
| 2.11 重组表达菌株降解异丙隆速度比较 | 第78页 |
| 2.12 E. coli BL21(DE3)(pETAB/pBBR341)的底物谱 | 第78-85页 |
| 2.13 基因簇水平转移分析 | 第85-86页 |
| 本章讨论 | 第86-91页 |
| 本章小结 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-97页 |
| 第二章 DDIPU水解酶基因ddhA的克隆、表达及其酶学特性的研究 | 第97-125页 |
| 1 材料和方法 | 第97-104页 |
| 1.1 试剂与培养基 | 第97-98页 |
| 1.2 供试菌株和质粒 | 第98页 |
| 1.3 突变株YBL2-Mut的获得 | 第98页 |
| 1.4 YBL2-Mut总DNA的提取及测序 | 第98页 |
| 1.5 全基因组序列比较 | 第98-99页 |
| 1.6 丢失片段的验证 | 第99页 |
| 1.7 丢失片段DNA序列分析 | 第99页 |
| 1.8 疑似ORF功能的初步验证 | 第99-100页 |
| 1.9 水解酶基因的PCR扩增 | 第100-101页 |
| 1.10 表达载体pET24b-ddhA的构建 | 第101页 |
| 1.11 表达菌株的构建和诱导表达 | 第101-102页 |
| 1.12 水解酶的纯化 | 第102页 |
| 1.13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第102-103页 |
| 1.14 DdhA酶活性检测的反应体系及其功能验证 | 第103页 |
| 1.15 DdhA酶学特性的研究 | 第103-104页 |
| 1.16 其它异丙隆降解菌株中水解酶基因的扩增 | 第104页 |
| 2 结果与分析 | 第104-119页 |
| 2.1 YBL2-Mut的获得及其降解特性 | 第104-105页 |
| 2.2 YBL2-Mut的全基因组测序及其比对 | 第105-106页 |
| 2.3 丢失片段的DNA序列分析 | 第106-107页 |
| 2.4 水解酶基因ddhA功能初步验证 | 第107-109页 |
| 2.5 异源表达载体pET24b-ddhA的构建 | 第109-110页 |
| 2.6 水解酶DdhA的纯化 | 第110页 |
| 2.7 纯酶功能的验证 | 第110-112页 |
| 2.8 环境条件对酶催化活性的影响 | 第112-114页 |
| 2.9 水解酶DdhA的底物谱及相应的动力学参数 | 第114-118页 |
| 2.10 降解基因ddhA高度保守 | 第118-119页 |
| 本章讨论 | 第119-122页 |
| 本章小结 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-125页 |
| 第三章 取代脲类除草剂降解菌株Pu21的分离、鉴定及降解特性研究 | 第125-149页 |
| 1 材料与方法 | 第125-131页 |
| 1.1 培养基与试剂 | 第125-126页 |
| 1.2 降解菌株的分离筛选 | 第126页 |
| 1.3 降解菌株的生理生化鉴定 | 第126页 |
| 1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的PCR扩增和鉴定 | 第126-129页 |
| 1.5 降解菌株系统发育地位的确定 | 第129页 |
| 1.6 种子液的制备与菌体生长量的测定 | 第129页 |
| 1.7 菌株Pu21利用IPU和LGL为唯一碳源生长和降解 | 第129页 |
| 1.8 环境因素对菌株降解取代脲类除草剂的影响 | 第129-130页 |
| 1.9 异丙隆和利谷隆及其中间代谢产物的检测方法 | 第130页 |
| 1.10 菌株对不同底物降解的研究 | 第130-131页 |
| 2 结果与分析 | 第131-143页 |
| 2.1 取代脲类除草剂降解菌株Pu21的分离筛选 | 第131页 |
| 2.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征 | 第131-132页 |
| 2.3 降解菌株的系统发育树分析 | 第132-133页 |
| 2.4 菌株Pu21的抗性谱 | 第133-134页 |
| 2.5 菌株以异丙隆和利谷隆为唯一碳源的生长和降解 | 第134-135页 |
| 2.6 温度对菌株降解异丙隆和利谷隆的影响 | 第135-136页 |
| 2.7 pH对菌株降解异丙隆和利谷隆的影响 | 第136页 |
| 2.8 NaCl浓度对菌株降解异丙隆和利谷隆的影响 | 第136-137页 |
| 2.9 外加碳源对菌株降解异丙隆和利谷隆的影响 | 第137页 |
| 2.10 菌株降解异丙隆和利谷隆的代谢途径 | 第137-142页 |
| 2.11 菌株Pu21降解取代脲类除草剂的降解谱 | 第142-143页 |
| 本章讨论 | 第143-145页 |
| 本章小结 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-149页 |
| 全文总结 | 第149-151页 |
| 本论文主要创新点 | 第151-153页 |
| 附录一 培养基及试剂配方 | 第153-155页 |
| 附录二 基因序列 | 第155-159页 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的论文 | 第159-161页 |
| 致谢 | 第161页 |
