| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-21页 |
| 1.1 苯基乳酸的理化性质 | 第12页 |
| 1.2 苯基乳酸的应用价值 | 第12-14页 |
| 1.2.1 苯基乳酸的抗菌性及其在食品行业中的应用 | 第12-13页 |
| 1.2.2 苯基乳酸在动物饲料中的应用 | 第13页 |
| 1.2.3 苯基乳酸在医药中的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.4 苯基乳酸在化妆品工业中的应用 | 第14页 |
| 1.3 苯基乳酸的合成方法 | 第14-16页 |
| 1.3.1 化学合成苯基乳酸 | 第14页 |
| 1.3.2 生物转化合成苯基乳酸 | 第14-16页 |
| 1.4 合成苯基乳酸微生物种质资源的开发 | 第16-18页 |
| 1.4.1 自然界中高产菌株的筛选 | 第16-17页 |
| 1.4.2 利用基因工程技术构建高产菌株 | 第17-18页 |
| 1.5 本课题研究背景、意义及内容 | 第18-21页 |
| 第二章 高产D-苯基乳酸重组大肠杆菌的构建 | 第21-39页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第21-22页 |
| 2.2.2 主要生化试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.3 实验试剂的配制 | 第23页 |
| 2.2.4 仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.2.5 培养基的配制 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-29页 |
| 2.3.1 植物乳酸菌基因组的提取 | 第24页 |
| 2.3.2 乳酸脱氢酶基因PCR扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.3 PCR产物纯化回收 | 第25页 |
| 2.3.4 大肠杆菌高效感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 2.3.5 乳酸脱氢酶基因片段与p MD19-T Simple Vector连接、转化 | 第25-26页 |
| 2.3.6 质粒提取与酶切验证及菌落PCR验证 | 第26-27页 |
| 2.3.7 表达载体p ET28a-ldh的构建 | 第27页 |
| 2.3.8 SDS-PAGE电泳验证重组蛋白表达 | 第27页 |
| 2.3.9 乳酸脱氢酶酶活的测定 | 第27-28页 |
| 2.3.10 重组大肠杆菌全细胞的制备与转化条件的建立 | 第28页 |
| 2.3.11 高效液相色谱苯基乳酸的测定 | 第28-29页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第29-38页 |
| 2.4.1 植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因的克隆 | 第29-31页 |
| 2.4.2 克隆载体p MD19-T-ldh的构建、转化与验证 | 第31-32页 |
| 2.4.3 表达载体p ET-28a-ldh的构建、转化与验证 | 第32-33页 |
| 2.4.4 重组大肠杆菌乳酸脱氢酶诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.4.5 乳酸脱氢酶酶活的测定 | 第34-35页 |
| 2.4.6 全细胞转化苯丙酮酸合成D-苯基乳酸的测定 | 第35-37页 |
| 2.4.7 重组大肠杆菌全细胞转化苯丙酮酸生成苯基乳酸 | 第37-38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第三章 重组大肠杆菌突变株的构建及转化条件优化 | 第39-51页 |
| 3.1 前言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39-40页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第39-40页 |
| 3.2.2 主要生化试剂及相关试剂的配制 | 第40页 |
| 3.3 实验方法 | 第40-42页 |
| 3.3.1 重组质粒p ET-28a-ldh的提取 | 第40页 |
| 3.3.2 乳酸脱氢酶基因的定点突变 | 第40-41页 |
| 3.3.3 突变株乳酸脱氢酶酶活的测定 | 第41页 |
| 3.3.4 重组大肠杆菌诱导条件的优化 | 第41页 |
| 3.3.5 重组大肠杆菌转化条件的优化 | 第41-42页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第42-50页 |
| 3.4.1 突变株的构建、转化与表达 | 第42页 |
| 3.4.2 突变株酶活的测定及对合成苯基乳酸的影响 | 第42-43页 |
| 3.4.3 诱导条件的优化 | 第43-45页 |
| 3.4.4 转化条件的优化 | 第45-48页 |
| 3.4.5 重组大肠杆菌单批次生物转化 | 第48-49页 |
| 3.4.6 重组大肠杆菌底物流加生物转化 | 第49-50页 |
| 3.5 本章小结 | 第50-51页 |
| 第四章 重组大肠杆菌辅酶再生体系的构建 | 第51-64页 |
| 4.1 前言 | 第51-52页 |
| 4.2 实验材料 | 第52页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第52页 |
| 4.2.2 试验试剂及配置 | 第52页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第52页 |
| 4.3 实验方法 | 第52-54页 |
| 4.3.1 辅因子再生工程菌的构建 | 第52-53页 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 | 第53页 |
| 4.3.3 重组大肠杆菌酶活的测定 | 第53页 |
| 4.3.4 摇瓶中单批次培养 | 第53页 |
| 4.3.5 不同时间点胞内辅酶 | 第53页 |
| 4.3.6 全细胞重复性转化分析 | 第53-54页 |
| 4.3.7 全细胞转化菌体活性的分析 | 第54页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第54-62页 |
| 4.4.1 重组大肠杆菌辅酶再生体系的构建 | 第54-55页 |
| 4.4.2 双基因表达重组蛋白SDS-PAGE验证 | 第55-56页 |
| 4.4.3 LDH、FDH和ZWF酶活测定 | 第56-57页 |
| 4.4.4 重组大肠杆菌单批次发酵产苯基乳酸比较 | 第57-58页 |
| 4.4.5 辅因子再生体系对胞内辅酶水平的影响 | 第58-59页 |
| 4.4.6 分批流加底物合成苯基乳酸 | 第59-61页 |
| 4.4.7 全细胞重复利用试验 | 第61-62页 |
| 4.4.8 MTT法测定菌体活力 | 第62页 |
| 4.5 本章小结 | 第62-64页 |
| 总结与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
