| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 前言 | 第10-22页 |
| ·7-氨基头孢烷酸(7-ACA)概述 | 第10-11页 |
| ·7-ACA的生产方法 | 第10页 |
| ·酶法生产7-ACA简介 | 第10-11页 |
| ·D-氨基酸氧化酶 | 第11-17页 |
| ·微生物中D-氨基酸的氧化反应 | 第11-12页 |
| ·微生物D-氨基酸氧化酶的性质 | 第12-15页 |
| ·D-氨基酸氧化酶的生产 | 第15-17页 |
| ·应用D-氨基酸氧化酶生产7-ACA | 第17页 |
| ·头孢菌素酰化酶 | 第17-20页 |
| ·头孢菌素酰化酶的分类 | 第17-18页 |
| ·头孢菌素酰化酶的克隆表达 | 第18-19页 |
| ·头孢菌素C酰化酶 | 第19-20页 |
| ·课题内容及意义 | 第20-22页 |
| 第2章 材料与方法 | 第22-39页 |
| ·材料 | 第22-26页 |
| ·质粒、菌株和引物 | 第22-23页 |
| ·实验试剂 | 第23-24页 |
| ·实验仪器 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·溶液 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26-39页 |
| ·分子生物学方法 | 第26-28页 |
| ·P.pastoris的摇瓶发酵 | 第28页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第28-29页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第29页 |
| ·DAAO酶活测定 | 第29-31页 |
| ·CPC酰化酶酶活测定 | 第31-32页 |
| ·R.gracilis培养条件 | 第32页 |
| ·R.gracilis总RNA提取 | 第32页 |
| ·反转录 | 第32页 |
| ·RgDAAO基因的扩增 | 第32-33页 |
| ·RgDAAO表达载体pET28a-RgDAAO的构建 | 第33页 |
| ·重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET28a-RgDAAO的构建 | 第33页 |
| ·RgDAAO基因的诱导表达 | 第33-34页 |
| ·易错PCR扩增野生型RgDAAO基因 | 第34-35页 |
| ·RgDAAO突变文库的构建 | 第35页 |
| ·菌落PCR鉴定重组子 | 第35页 |
| ·高通量筛选方法的验证 | 第35-36页 |
| ·随机突变文库的筛选 | 第36页 |
| ·野生型RgDAAO及突变株酶动力学参数测定 | 第36页 |
| ·DAAO的结构预测和位点分析 | 第36页 |
| ·VACs基因的扩增 | 第36页 |
| ·VACS表达载体pET28a-VACS的构建 | 第36-37页 |
| ·VACs表达载体pPIC3.5K-VACs的构建 | 第37页 |
| ·重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET28a-VACs的构建 | 第37页 |
| ·重组菌P.pasloris GS115/pPIC3.5K-VACs的构建 | 第37-39页 |
| 第3章 D-氨基酸氧化酶的克隆与大肠杆菌系统表达 | 第39-43页 |
| ·引言 | 第39页 |
| ·RgDAAO基因在E.coli中的克隆与表达 | 第39-41页 |
| ·重组质粒pET28a-RgDAAO的构建 | 第39-41页 |
| ·重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET28a-RgDAAO的构建 | 第41页 |
| ·RgDAAO基因的表达及SDS-PAGE鉴定 | 第41页 |
| ·RgDAAO酶活测定 | 第41页 |
| ·讨论 | 第41-42页 |
| ·本章小结 | 第42-43页 |
| 第4章 D-氨基酸氧化酶RgDAAO的定向进化 | 第43-59页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·易错PCR条件的确立 | 第43-46页 |
| ·连接体系的优化 | 第46页 |
| ·高通量筛选方法的验证 | 第46-48页 |
| ·预培养板细胞密度一致性验证 | 第47页 |
| ·主培养板RgDAAO比酶活一致性验证 | 第47-48页 |
| ·突变株的筛选和鉴定 | 第48-49页 |
| ·48深孔板筛选 | 第48页 |
| ·突变株M3217的表达及纯化 | 第48-49页 |
| ·野生型RgDAAO和突变株M3217酶动力学参数测定 | 第49-50页 |
| ·突变株基因序列分析 | 第50页 |
| ·突变株三维结构预测和氨基酸突变位点分析 | 第50-51页 |
| ·突变株M3217在大肠杆菌系统中的表达条件优化 | 第51-56页 |
| ·最佳诱导菌龄的确定 | 第51-52页 |
| ·最佳IPTG诱导浓度的确定 | 第52-53页 |
| ·最佳诱导温度的确定 | 第53-54页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第54-56页 |
| ·讨论 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-59页 |
| 第5章 头孢菌素C酰化酶基因VACs的表达优化研究 | 第59-71页 |
| ·引言 | 第59页 |
| ·VACs基因在E.coli中的克隆与表达 | 第59-66页 |
| ·重组质粒pET28a-VACs的构建 | 第59-60页 |
| ·重组菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET28a-VACs的构建 | 第60页 |
| ·E.coli BL21(DE3)pLysS/pET28a-VACs的诱导表达和SDS-PAGE验证 | 第60-61页 |
| ·VACs在E.coli中的表达优化 | 第61-66页 |
| ·VACs在P.pastoris中的表达 | 第66-68页 |
| ·重组质粒pPIC3.5K-VACs的构建 | 第66-67页 |
| ·胞内表达重组菌P.pastoris GS115/pPIC3.5K-VACs的构建 | 第67-68页 |
| ·重组菌P.pastoris GS115/pPIC3.5K-VACs的诱导表达 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-70页 |
| ·本章小结 | 第70-71页 |
| 第6章 结论与展望 | 第71-73页 |
| ·结论 | 第71-72页 |
| ·展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
