| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-20页 |
| ·弓形虫病及其危害 | 第13-14页 |
| ·速殖子-缓殖子转换及重要的期特异性表达抗原 | 第14-16页 |
| ·弓形虫病诊断方法的研究 | 第16-18页 |
| ·病原学诊断方法 | 第16页 |
| ·免疫学诊断方法 | 第16-17页 |
| ·分子生物学诊断方法 | 第17-18页 |
| ·弓形虫与动物性食品安全 | 第18-20页 |
| 2 研究目的及意义 | 第20-21页 |
| 3 材料与方法 | 第21-34页 |
| ·试验材料 | 第21-24页 |
| ·质粒、菌株、虫株及实验动物 | 第21页 |
| ·酶及试剂盒 | 第21-22页 |
| ·质粒抽提试剂 | 第22页 |
| ·SDS-PAGE缓冲液 | 第22页 |
| ·Western-blot缓冲液 | 第22页 |
| ·细菌培养基 | 第22-23页 |
| ·ELISA缓冲液 | 第23页 |
| ·血清及酶标二抗 | 第23页 |
| ·其他溶液 | 第23-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-34页 |
| ·弓形虫BAG1基因CDS的克隆 | 第24-25页 |
| ·引物设计 | 第24页 |
| ·组织包囊的收集与纯化 | 第24-25页 |
| ·缓殖子总RNA的提取 | 第25页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第25页 |
| ·PCR反应体系及程序 | 第25页 |
| ·SAG1基因CDS的体外扩增 | 第25-26页 |
| ·引物设计 | 第25-26页 |
| ·弓形虫速殖子基因组DNA的提取 | 第26页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第26页 |
| ·重组表达质粒的构建及外源DNA序列测定 | 第26-29页 |
| ·pMD18-T和目的基因片段的连接 | 第26-27页 |
| ·大肠杆菌DH5α/BL21感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·连接产物的转化 | 第27页 |
| ·重组质粒DNA碱裂解法小量制备 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·重组表达质粒的构建与鉴定 | 第28-29页 |
| ·弓形虫BAG1基因及SAG1基因在大肠杆菌中的原核表达 | 第29-31页 |
| ·重组表达质粒的诱导表达 | 第29页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第29页 |
| ·表达产物存在形式的检测 | 第29-30页 |
| ·最佳IPTG浓度的确定 | 第30页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第30页 |
| ·不溶性表达产物(包涵体)的提取 | 第30页 |
| ·Western-blot试验 | 第30-31页 |
| ·rBAG1间接ELISA及rSAG1间接ELISA方法的建立 | 第31-33页 |
| ·ELISA操作步骤 | 第31-32页 |
| ·抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 | 第32页 |
| ·最佳封闭浓度和最佳封闭时间的确定 | 第32页 |
| ·血清最佳作用时间的确定 | 第32页 |
| ·二抗最佳浓度和最佳作用时间的确定 | 第32页 |
| ·ELISA阴阳性临界点的确定 | 第32-33页 |
| ·ELISA特异性试验 | 第33页 |
| ·ELISA敏感性试验 | 第33页 |
| ·ELISA重复性试验 | 第33页 |
| ·ELISA保质期试验 | 第33页 |
| ·猪急慢性弓形虫感染ELISA鉴别诊断方法的初步应用 | 第33-34页 |
| 4 结果与分析 | 第34-56页 |
| ·弓形虫BAG1基因的原核表达 | 第34-40页 |
| ·弓形虫组织包囊的收集与纯化 | 第34页 |
| ·弓形虫缓殖子总RNA的提取 | 第34页 |
| ·弓形虫BAG1基因CDS的PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pMD18-T-BAG1的酶切鉴定 | 第35页 |
| ·重组表达质粒pET28a(+)-BAG1的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组表达质粒pET28a(+)-BAG1的测序与比对分析 | 第36-37页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-BAG1在E.coli中的表达 | 第37-38页 |
| ·pET28a(+)-BAG1原核表达产物存在形式的分析 | 第38页 |
| ·pET28a(+)-BAG1/BL21最佳诱导表达条件的分析 | 第38-39页 |
| ·重组蛋白rBAG1的Western-blot分析 | 第39-40页 |
| ·弓形虫SAG1基因的原核表达 | 第40-44页 |
| ·弓形虫SAG1基因CDS的PCR扩增 | 第40页 |
| ·重组质粒pMD18-T-SAG1的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·重组表达质粒pET28a(+)-SAG1的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组表达质粒pET28a(+)-SAG1的测序与比对分析 | 第41-42页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-SAG1在E.coli中的表达 | 第42-43页 |
| ·pET28a(+)-SAG1原核表达产物存在形式的分析 | 第43页 |
| ·重组蛋白rSAG1的Western-blot分析 | 第43-44页 |
| ·rBAG1间接ELISA方法的建立 | 第44-49页 |
| ·抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第44-45页 |
| ·最佳封闭浓度和最佳封闭时间的确定 | 第45页 |
| ·血清最佳作用时间的确定 | 第45-46页 |
| ·二抗最佳浓度及最佳作用时间的确定 | 第46-47页 |
| ·ELISA阴阳性临界点的确定 | 第47页 |
| ·ELISA特异性试验 | 第47页 |
| ·ELISA敏感性试验 | 第47-48页 |
| ·ELISA重复性试验 | 第48-49页 |
| ·ELISA保质期试验 | 第49页 |
| ·rSAG1间接ELISA方法的建立 | 第49-54页 |
| ·抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第49-50页 |
| ·最佳封闭浓度和最佳封闭时间的确定 | 第50页 |
| ·血清最佳作用时间的确定 | 第50-51页 |
| ·二抗最佳浓度及最佳作用时间的确定 | 第51-52页 |
| ·ELISA阴阳性临界点的确定 | 第52页 |
| ·ELISA特异性试验 | 第52页 |
| ·ELISA敏感性试验 | 第52-53页 |
| ·ELISA重复性试验 | 第53-54页 |
| ·ELISA保质期试验 | 第54页 |
| ·猪急慢性弓形虫感染ELISA鉴别诊断方法的初步应用 | 第54-56页 |
| 5 讨论 | 第56-58页 |
| ·抗原的选择 | 第56页 |
| ·基因的克隆及表达 | 第56-57页 |
| ·ELISA方法的建立 | 第57页 |
| ·湖北省规模化猪场弓形虫病流行病学分析 | 第57-58页 |
| 6 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
