| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略词 | 第15-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 微生物中天然产物挖掘的发展历程及现状 | 第17-18页 |
| 1.2 海洋链霉菌 | 第18页 |
| 1.3 微生物中天产物的挖掘方法 | 第18-22页 |
| 1.3.1 概述 | 第18-19页 |
| 1.3.2 原位激活 | 第19-21页 |
| 1.3.3 异源表达 | 第21-22页 |
| 1.4 Red/ET技术在天然产物研究中的应用 | 第22-25页 |
| 1.4.1 Red/ET重组工程的简介 | 第22页 |
| 1.4.2 Red/ET重组工程的原理 | 第22-23页 |
| 1.4.3 Red/ET重组工程的发展与应用 | 第23-25页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第25-27页 |
| 第二章 材料和方法 | 第27-49页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第27-31页 |
| 2.2 抗生素 | 第31页 |
| 2.3 培养基 | 第31-32页 |
| 2.4 常用试剂和主要仪器 | 第32-34页 |
| 2.4.1 主要试剂(盒) | 第32-33页 |
| 2.4.2 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.5 实验方法 | 第34-49页 |
| 2.5.1 主要的技术路线 | 第35页 |
| 2.5.2 基因簇的直接克隆和初步修饰 | 第35-40页 |
| 2.5.3 启动子的添加 | 第40-43页 |
| 2.5.4 基因簇BGC1中基因的敲除 | 第43-44页 |
| 2.5.5 基因簇BGC21中基因的敲除与回补 | 第44-45页 |
| 2.5.6 实时逆转录PCR | 第45页 |
| 2.5.7 接合转移 | 第45页 |
| 2.5.8 链霉菌的发酵 | 第45-46页 |
| 2.5.9 发酵产物的提取和检测 | 第46-47页 |
| 2.5.10 目标产物的分离纯化和结构鉴定 | 第47-49页 |
| 第三章 实验结果 | 第49-89页 |
| 3.1 Streptomyces sp. B59全基因组测序 | 第49-50页 |
| 3.2 OSMAC方法的初步探索 | 第50-54页 |
| 3.2.1 抗菌活性产物的发现 | 第50-52页 |
| 3.2.2 活性产物的分离 | 第52页 |
| 3.2.3 新颖大环内酯类化合物B59-1的分离和结构鉴定 | 第52-54页 |
| 3.3 BGC1基因簇的异源表达 | 第54-62页 |
| 3.3.1 BGC1生物合成基因簇的生物学分析 | 第54-56页 |
| 3.3.2 BGC1的直接克隆和初步修饰 | 第56页 |
| 3.3.3 在异源宿主中表达BGC1 | 第56-59页 |
| 3.3.4 BGC1异源表达产物的分离 | 第59-60页 |
| 3.3.5 BGC1基因的敲除 | 第60-62页 |
| 3.3.6 活性测定 | 第62页 |
| 3.4 BGC2基因簇的异源表达 | 第62-68页 |
| 3.4.1 BGC2生物合成基因簇的生物学分析 | 第62-64页 |
| 3.4.2 BGC2基因簇的直接克隆和初步修饰 | 第64页 |
| 3.4.3 异源表达激活BGC2 | 第64-68页 |
| 3.5 BGC3基因簇激活的失败 | 第68-70页 |
| 3.5.1 BGC3生物合成基因簇的生物学分析 | 第68-69页 |
| 3.5.2 BGC3基因簇的直接克隆和初步修饰 | 第69页 |
| 3.5.3 BGC3基因簇激活的尝试 | 第69-70页 |
| 3.6 BGC6基因簇的异源表达 | 第70-74页 |
| 3.6.1 BGC6生物合成基因簇的生物学分析 | 第70-72页 |
| 3.6.2 BGC6基因簇的直接克隆和初步修饰 | 第72页 |
| 3.6.3 异源表达激活BGC6 | 第72-74页 |
| 3.6.4 BGC6产物的分离纯化 | 第74页 |
| 3.7 BGC21基因簇的异源表达 | 第74-89页 |
| 3.7.1 BGC21生物合成基因簇的生物学分析 | 第74-76页 |
| 3.7.2 BGC21的直接克隆和初步修饰 | 第76-77页 |
| 3.7.3 异源表达激活BGC21 | 第77-79页 |
| 3.7.4 产物的分离和结构鉴定 | 第79-81页 |
| 3.7.5 合成途径中基因的单敲除 | 第81-82页 |
| 3.7.6 PKS基因的表达和产物的鉴定 | 第82-85页 |
| 3.7.7 卤化酶的回补 | 第85-86页 |
| 3.7.8 基因bgc21-2和bgc21-5的RT-qPCR检测 | 第86-87页 |
| 3.7.9 pks失活后,未卤化产物的添加 | 第87-89页 |
| 第四章 讨论 | 第89-99页 |
| 4.1 异源表达的相关讨论 | 第89-90页 |
| 4.2 OSMAC实验的讨论 | 第90页 |
| 4.3 BGC1合成途径的激活和产物的研究 | 第90-93页 |
| 4.4 BGC2基因簇产物的推测 | 第93-95页 |
| 4.5 BGC3基因蔟激活失败的原因 | 第95-96页 |
| 4.6 BGC6的相关讨论 | 第96页 |
| 4.7 BGC21基因簇研究的相关结果讨论 | 第96-99页 |
| 第五章 总结和展望 | 第99-101页 |
| 5.1 总结 | 第99页 |
| 5.2 展望 | 第99-101页 |
| 附录一: 本文所用引物 | 第101-105页 |
| 参考文献 | 第105-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第114页 |
