| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-34页 |
| ·3-羟基丙酸概况 | 第20-23页 |
| ·3-羟基丙酸理化性质与用途 | 第20-22页 |
| ·3-羟基丙酸的生产方法 | 第22-23页 |
| ·3-羟基丙酸的生物合成途径 | 第23-26页 |
| ·代谢途径设计 | 第23-24页 |
| ·以葡萄糖为底物 | 第24-25页 |
| ·以甘油为底物 | 第25-26页 |
| ·生产菌种 | 第26-27页 |
| ·生理工程简介 | 第27-28页 |
| ·合成生物学与DNA组装技术简介 | 第28-33页 |
| ·引言 | 第28-29页 |
| ·体内组装DNA策略 | 第29-31页 |
| ·体外组装DNA策略 | 第31-33页 |
| ·本课题的立项意义 | 第33-34页 |
| 第二章 酿酒酵母醛脱氢酶ald4基因的克隆 | 第34-50页 |
| ·引言 | 第34页 |
| ·实验材料 | 第34-35页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·试剂与仪器 | 第34-35页 |
| ·培养基 | 第35页 |
| ·实验方法 | 第35-44页 |
| ·酿酒酵母S.cerevisiae基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因ald4 | 第36-37页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离目的基因ald4 | 第37-38页 |
| ·TA克隆构建质粒pMD 18-T-ald4 | 第38-39页 |
| ·质粒pMD 18-T-ald4转化大肠杆菌 | 第39页 |
| ·质粒pMD 18-T-ald4的鉴定 | 第39-41页 |
| ·质粒pKP-28a-ald4的构建 | 第41-42页 |
| ·质粒pKP-28a-ald4的鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组质粒pKP-28a-ald4电击法转化K.pneumoniae | 第43-44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-49页 |
| ·S.cerevisiae基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| ·聚合酶链式反应扩增基因ald4 | 第45-46页 |
| ·T载体重组子的鉴定 | 第46-47页 |
| ·ald4基因的序列测定与分析 | 第47页 |
| ·重组表达载体pKP-28a-ald4的构建与鉴定 | 第47-49页 |
| ·本章小结 | 第49-50页 |
| 第三章 共表达醛脱氢酶与甘油脱水酶基因及产3-羟基丙酸研究 | 第50-66页 |
| ·引言 | 第50页 |
| ·实验材料 | 第50-51页 |
| ·菌株、质粒、引物 | 第50-51页 |
| ·试剂与仪器 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-58页 |
| ·质粒pKP-28a-dhaB的构建 | 第51页 |
| ·ald4与dhaB基因串联共表达质粒的构建 | 第51-53页 |
| ·质粒载体的去磷酸化 | 第53页 |
| ·PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向 | 第53-54页 |
| ·重组质粒pKP-28a-AB电击法转化K.pneumoniae | 第54页 |
| ·醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB在K.pneumoniae中的表达 | 第54-57页 |
| ·重组菌的发酵培养 | 第57页 |
| ·高效液相色谱(HPLC)检测3-羟基丙酸产物浓度 | 第57页 |
| ·改进的高碘酸钠氧化法测定发酵液中的甘油浓度 | 第57-58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-64页 |
| ·质粒pKP-28a-dhaB的构建 | 第58-59页 |
| ·ald4-EcoR I-SD基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向 | 第60页 |
| ·串联共表达质粒pKP-28a-AB的鉴定 | 第60-61页 |
| ·重组菌共表达ald4与dhaB基因 | 第61-62页 |
| ·重组菌K.pneumoniae(pKP-28a-AB)以甘油为底物发酵生产3-羟基丙酸 | 第62-64页 |
| ·本章小结 | 第64-66页 |
| 第四章 重组菌K.pneumoniae生产3-羟基丙酸的研究 | 第66-76页 |
| ·引言 | 第66页 |
| ·实验材料 | 第66-67页 |
| ·菌株与质粒 | 第66页 |
| ·试剂与仪器 | 第66-67页 |
| ·培养基 | 第67页 |
| ·实验方法 | 第67-69页 |
| ·发酵条件与培养方法 | 第67页 |
| ·发酵参数测定与分析 | 第67-69页 |
| ·结果与讨论 | 第69-74页 |
| ·重组菌K.pneumoniae K2-AB的发酵特性 | 第69-70页 |
| ·重组菌K.pneumoniae K2-AB的放大培养研究 | 第70-72页 |
| ·重组菌K.pneumoniae Kp5-3-AB的产3-羟基丙酸研究 | 第72-74页 |
| ·本章小结 | 第74-76页 |
| 第五章 消除K.pneumoniae重组型质粒的方法与应用 | 第76-86页 |
| ·引言 | 第76页 |
| ·实验材料 | 第76-78页 |
| ·菌株与质粒 | 第76-77页 |
| ·试剂与仪器 | 第77页 |
| ·培养基 | 第77-78页 |
| ·实验方法 | 第78-79页 |
| ·连续传代法消除K.pneumoniae质粒 | 第78页 |
| ·SDS方法消除K.pneumoniae质粒 | 第78页 |
| ·质粒的再导入 | 第78页 |
| ·质粒消除在生理工程中的应用 | 第78-79页 |
| ·种子发酵培养 | 第79页 |
| ·结果与讨论 | 第79-85页 |
| ·连续传代培养对质粒消除的影响 | 第79-80页 |
| ·SDS方法消除重组质粒 | 第80-81页 |
| ·质粒消除菌重新导入新质粒 | 第81-82页 |
| ·质粒消除方法在生理工程中的应用 | 第82-85页 |
| ·本章小结 | 第85-86页 |
| 第六章 DNA快速组装技术的理论研究与应用 | 第86-98页 |
| ·引言 | 第86页 |
| ·实验材料 | 第86-87页 |
| ·菌株、质粒 | 第86页 |
| ·试剂与仪器 | 第86-87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| ·实验方法 | 第87-90页 |
| ·大肠杆菌E.coli基因组的提取 | 第87-88页 |
| ·大肠杆菌E.coli K-12 aldH基因的准备 | 第88页 |
| ·线性化质粒骨架的准备 | 第88页 |
| ·Polymerase cycling assembly(PCA)连接质粒骨架与插入基因 | 第88-90页 |
| ·结果与讨论 | 第90-97页 |
| ·利用DNA组装技术构建"细胞工厂" | 第90-93页 |
| Ⅰ.修建结构架构(Building structural frameworks) | 第91-92页 |
| Ⅱ.安装固定设备(Setting fixed parts) | 第92页 |
| Ⅲ.铺设管线(Laying pipelines) | 第92页 |
| Ⅳ.增添移动设施(Equipping mobile devices) | 第92页 |
| Ⅴ.安装调控软件(Installing regulatory software) | 第92-93页 |
| ·大肠杆菌E.coli K-12基因组DNA的提取 | 第93-94页 |
| ·大肠杆菌E.coli K-12 aldH基因的克隆 | 第94-95页 |
| ·质粒骨架pKP-28a-dhaB的线性化 | 第95页 |
| ·重组质粒pKP-28a-BH阳性克隆子的鉴定 | 第95-97页 |
| ·本章小结 | 第97-98页 |
| 第七章 实验总结与建议 | 第98-100页 |
| ·主要结论 | 第98-99页 |
| ·问题与建议 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-104页 |
| 附录1 试剂 | 第104-106页 |
| 附录2 仪器设备 | 第106-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第108-109页 |
