| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-28页 |
| ·同源重组技术的研究进展 | 第18-19页 |
| ·酵母菌表达系统的研究概况 | 第19-25页 |
| ·酵母表达外源基因的概述 | 第19-20页 |
| ·非常规酵母系的表达系统的开发策略与整合载体的应用 | 第20-23页 |
| ·整合型载体在非常规宿主中的应用 | 第20-21页 |
| ·整合质粒的不稳定性和同源整合机制 | 第21-23页 |
| ·乳酸克鲁维酵母的载体表达系统 | 第23-24页 |
| ·以rRNA介导的整合载体 | 第24-25页 |
| ·红酵母的研究概况 | 第25-26页 |
| ·红酵母的种属特性及分类 | 第25-26页 |
| ·红酵母的应用 | 第26页 |
| ·研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 粘红酵母As2.102生长特征和培养方法 | 第28-38页 |
| ·引言 | 第28页 |
| ·材料与方法 | 第28-31页 |
| ·菌种 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-31页 |
| ·细胞形态学观察 | 第29页 |
| ·细胞计数及活力测定 | 第29页 |
| ·生长速度的测定 | 第29-30页 |
| ·对常用抗生素的敏感型研究 | 第30页 |
| ·生理生化反应 | 第30-31页 |
| ·实验结果与讨论 | 第31-36页 |
| ·粘红酵母形态学特征 | 第31-32页 |
| ·确定培养条件、特征和生理生化特征 | 第32-33页 |
| ·粘红酵母的生长曲线 | 第33-34页 |
| ·细胞活力和生长速度 | 第34-35页 |
| ·粘红酵母对常用抗生素的敏感型研究 | 第35-36页 |
| ·本章小结 | 第36-38页 |
| 第三章 粘红酵母26SrDNA D1/D2和5.8S-ITS区域基因克隆、序列分析及原核表达载体的构建 | 第38-54页 |
| ·引言 | 第38-39页 |
| ·材料与方法 | 第39-44页 |
| ·菌株与质粒 | 第39-40页 |
| ·实验方法 | 第40-44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-53页 |
| ·pPICZ-26SrD和pPICZ-5.8SrD原核表达载体的构建思路 | 第44页 |
| ·粘红酵母基因组的制备 | 第44-45页 |
| ·rDNA的PCR扩增 | 第45-47页 |
| ·PMD-rRNA质粒的构建 | 第47-50页 |
| ·pPICZ-26SrD和pPICZ-5.8SrD重组质粒的构建 | 第50-53页 |
| ·pPICZaA质粒提取及双酶切 | 第50-51页 |
| ·连接产物转化E.coli并验证 | 第51页 |
| ·重组质粒的转化与筛选 | 第51-52页 |
| ·pPICZ-5.8SrD重组质粒的筛选 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 粘红酵母整合型表达载体pGAPZ-rD-GFP的构建 | 第54-70页 |
| ·引言 | 第54页 |
| ·材料与方法 | 第54-57页 |
| ·实验材料 | 第54-56页 |
| ·菌株和质粒 | 第54-55页 |
| ·培养基 | 第55-56页 |
| ·酶和试剂(盒) | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-57页 |
| ·基本操作 | 第56页 |
| ·粘红酵母染色体的提取 | 第56页 |
| ·酵母LiAC转化法/完整细胞转化 | 第56页 |
| ·重组酵母的筛选方法 | 第56-57页 |
| ·质粒稳定性的测定方法 | 第57页 |
| ·实验结果与讨论 | 第57-68页 |
| ·载体构建流程 | 第57-58页 |
| ·中间载体pPICZ-rD的构建 | 第58-60页 |
| ·载体pPICZ-5.8SrD和pMD-26SrD目的片段酶切与胶回收 | 第59页 |
| ·连接和转化DH5α | 第59页 |
| ·重组筛选载体筛选和验证 | 第59-60页 |
| ·重组载体pPICZ-rD的结构示意图 | 第60页 |
| ·酿酒酵母启动子GAP的获得 | 第60-61页 |
| ·gfp基因序列的获得 | 第61-62页 |
| ·连接启动子片段和GFP基因并添加新的酶切位点 | 第62-64页 |
| ·双酶切反应 | 第64-67页 |
| ·重组质粒的转化 | 第67页 |
| ·重组酵母中质粒的稳定性研究 | 第67-68页 |
| ·本章小结 | 第68-70页 |
| 第五章 粘红酵母原生质体的制备、再生及转化 | 第70-84页 |
| ·本章引言 | 第70页 |
| ·材料和方法 | 第70-72页 |
| ·药品和各种酶试剂 | 第70-71页 |
| ·培养基及主要溶液的配制 | 第71-72页 |
| ·主要仪器与设备 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-74页 |
| ·菌种培养 | 第73页 |
| ·原生质体的制备 | 第73页 |
| ·原生质体的再生 | 第73-74页 |
| ·原生质体的转化 | 第74页 |
| ·结果和分析 | 第74-83页 |
| ·原生质体的制备 | 第74-79页 |
| ·酶浓度、作用温度和时间对原生质体制备和再生的影响 | 第74-76页 |
| ·菌龄对原生质体制备的影响 | 第76页 |
| ·酶解方式对原生质体制备的影响 | 第76-77页 |
| ·渗透压稳定剂种类对原生质制备的影响 | 第77-78页 |
| ·预处理对原生质体制备的影响 | 第78-79页 |
| ·原生质体的再生 | 第79-80页 |
| ·不同再生培养基对原生质体再生率的影响 | 第79-80页 |
| ·不同培养方法对原生质体再生率的影响 | 第80页 |
| ·原生质体的转化方法建立 | 第80-83页 |
| ·改良的转化方法 | 第81-82页 |
| ·绿色荧光蛋白的鉴定方法 | 第82-83页 |
| ·本章小结 | 第83-84页 |
| 第六章 R.glutinis As2.102自身启动子克隆方法的建立 | 第84-96页 |
| ·引言 | 第84页 |
| ·材料与方法 | 第84-86页 |
| ·实验材料 | 第85页 |
| ·实验方法 | 第85-86页 |
| ·探针质粒载体筛选启动子的策略流程 | 第85页 |
| ·PCR扩增克隆基因的启动子序列 | 第85-86页 |
| ·实验结果与讨论 | 第86-93页 |
| ·启动子探针质粒筛选启动子 | 第86-90页 |
| ·构建pMD18T为基础的启动子探针载体 | 第87页 |
| ·R.glutinis基因组部分酶切 | 第87页 |
| ·拟大量基因组部分酶切片段的制备 | 第87-88页 |
| ·用不同酶对R.glutinis基因组进行酶切 | 第88页 |
| ·拟后续的重组子验证和启动子功能检测 | 第88-89页 |
| ·酶切实验分析 | 第89-90页 |
| ·PCR克隆启动子 | 第90-93页 |
| ·设计蔗糖酶基因的简并引物 | 第90-91页 |
| ·R.glutinis的RNA提取 | 第91-92页 |
| ·克隆得到的序列分析 | 第92页 |
| ·克隆失败原因和改进设计 | 第92页 |
| ·拟染色体步移法扩增蔗糖酶基因的启动子序列流程 | 第92-93页 |
| ·本章小结 | 第93-96页 |
| 第七章 结论与建议 | 第96-100页 |
| ·结论 | 第96-97页 |
| ·展望与建议 | 第97页 |
| ·创新点 | 第97-100页 |
| 参考文献 | 第100-106页 |
| 附录 | 第106-110页 |
| 致谢 | 第110-112页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第112-114页 |
| 作者和导师简介 | 第114-115页 |
| 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第115-116页 |
