| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-18页 |
| ·引言 | 第13页 |
| ·酶工程研究现状 | 第13-14页 |
| ·本论文的研究目的与内容 | 第14-16页 |
| 参考文献 | 第16-18页 |
| 第二章 脂肪酶及枯草杆菌脂肪酶A的研究进展 | 第18-58页 |
| ·脂肪酶研究进展 | 第18-22页 |
| ·脂肪酶简介 | 第18-19页 |
| ·脂肪酶的结构及功能 | 第19页 |
| ·脂肪酶功能和性质的调控 | 第19-22页 |
| ·酶热稳定性调节 | 第20-21页 |
| ·酶催化活力调节 | 第21-22页 |
| ·基因突变对酶功能及性质的影响 | 第22-28页 |
| ·基因突变提高酶的热稳定性 | 第22-23页 |
| ·基因突变影响酶催化混乱性 | 第23-24页 |
| ·基因突变对脂肪酶立体选择性的影响 | 第24-28页 |
| ·枯草芽孢杆菌脂肪酶的研究进展 | 第28-38页 |
| ·枯草杆菌介绍 | 第28-29页 |
| ·枯草芽孢杆菌脂肪酶A的结构研究进展 | 第29-33页 |
| ·枯草芽孢杆菌脂肪酶A的生化性质研究进展 | 第33-38页 |
| ·实验研究方法 | 第38-39页 |
| ·合理酶设计 | 第38-39页 |
| ·定向进化 | 第39页 |
| ·论研究方法 | 第39-47页 |
| ·分子对接 | 第41-43页 |
| ·QSAR | 第43页 |
| ·Molecular Dynamic Simulation | 第43-45页 |
| ·QM/MM | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-58页 |
| 第三章 脂肪酶A的基因克隆与突变及表达纯化 | 第58-74页 |
| ·引言 | 第58页 |
| ·材料与方法 | 第58-67页 |
| ·实验仪器 | 第58页 |
| ·实验试剂 | 第58-59页 |
| ·实验菌株及质柆载体 | 第59页 |
| ·溶液配制 | 第59-61页 |
| ·枯草杆菌基因组的提取 | 第61页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A基因的获取,PCR扩增,引物设计 | 第61-62页 |
| ·PCR产物的回收 | 第62页 |
| ·质粒的提取 | 第62-63页 |
| ·pET-28a-Lipase A重组载体的构建 | 第63-64页 |
| ·重组枯草杆菌脂肪酶A原核表达及纯化 | 第64-65页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A突变体的构建 | 第65-67页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第67-68页 |
| ·测序鉴定 | 第68-70页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-74页 |
| 第四章 脂肪酶A热点残基的突变体与底物结合行为研究 | 第74-93页 |
| ·引言 | 第74-76页 |
| ·实验部分 | 第76页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A基因的克隆 | 第76页 |
| ·构建表达载体 | 第76页 |
| ·定点突变 | 第76页 |
| ·重组蛋白的表达和纯化 | 第76页 |
| ·脂肪酶A及其突变体对于底物pNPP的Km值测定 | 第76页 |
| ·脂肪酶A结构模型与计算方法 | 第76-80页 |
| ·构建脂肪酶A结构模型 | 第76-77页 |
| ·结构平衡和优化 | 第77-78页 |
| ·底物对接 | 第78页 |
| ·杂化QM/MM计算 | 第78-80页 |
| ·模拟计算确定脂肪酶A的热点残基 | 第80-82页 |
| ·分子对接模拟分析酶-底物的结合模式 | 第82-84页 |
| ·脂肪酶A的突变体Km值测定 | 第84-85页 |
| ·论模型和实验结果的相关性研究 | 第85-87页 |
| ·小结 | 第87-90页 |
| 参考文献 | 第90-93页 |
| 第五章 脂肪酶A饱和突变体水解活力的实验与模拟计算 | 第93-120页 |
| ·引言 | 第93-95页 |
| ·实验和理论方法 | 第95-97页 |
| ·实验部分 | 第95-96页 |
| ·论部分 | 第96-97页 |
| ·虚拟突变体构建 | 第96页 |
| ·动力学优化 | 第96页 |
| ·QM/MM优化 | 第96-97页 |
| ·AIM分析 | 第97页 |
| ·氨基酸残基间的作用能计算 | 第97页 |
| ·脂肪酶A及其突变体对pNPP的水解活力实验 | 第97-98页 |
| ·虚拟突变体与理论模拟计算 | 第98-101页 |
| ·虚拟突变体的构建 | 第98-100页 |
| ·Gromacs动力学模拟 | 第100-101页 |
| ·12号位点疏水氨基酸对活力影响与模拟计算研究 | 第101-108页 |
| ·12号位点极性氨基酸对活力影响与模拟计算研究 | 第108-112页 |
| ·12号位点氨基酸电荷性质对活力影响与模拟计算研究 | 第112-115页 |
| ·小结 | 第115-117页 |
| 参考文献 | 第117-120页 |
| 第六章 脂肪酶A催化立体选择性反应的模拟计算研究 | 第120-137页 |
| ·引言 | 第120-122页 |
| ·计算方法与实验方法 | 第122-126页 |
| ·构建脂肪酶A结构模型 | 第122页 |
| ·底物对接分析 | 第122-124页 |
| ·杂化QM/MM计算酶/底物复合物结合能 | 第124-125页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A基因的克隆和表达 | 第125页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A对酮洛酚乙烯酯立体选择性的确定 | 第125-126页 |
| ·脂肪酶A结合口袋结构模拟计算分析 | 第126-127页 |
| ·脂肪酶A热点残基与酮洛酚乙烯酯作用模拟计算分析 | 第127-129页 |
| ·脂肪酶A/酮洛酚乙烯酯复合物的结合能计算分析 | 第129-131页 |
| ·脂肪酶A对酮洛酚乙烯酯立体选择性实验确证 | 第131-133页 |
| ·小结 | 第133-134页 |
| 参考文献 | 第134-137页 |
| 第七章 反向定量构效关系研究脂肪酶A活性中心结构对立体选择性影响 | 第137-153页 |
| ·引言 | 第137-139页 |
| ·方法 | 第139-142页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A12号位点饱和突变 | 第139页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A突变体对酮洛酚乙烯酯的立体选择性 | 第139页 |
| ·枯草杆菌脂肪酶A虚拟突变体的构建及动力学优化 | 第139页 |
| ·蛋白质内部非键作用表征 | 第139-142页 |
| ·脂肪酶A饱和突变体对酮洛酚乙烯酯的立体选择性 | 第142-143页 |
| ·脂肪酶A饱和突变体分子动力学模拟 | 第143-145页 |
| ·反向定量构效关系分析研究脂肪酶A结构与立体选择性间统计关系 | 第145-149页 |
| ·小结 | 第149-151页 |
| 参考文献 | 第151-153页 |
| 第八章 总结 | 第153-155页 |
| 附录: 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第155-156页 |
| 致谢 | 第156-158页 |
