| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 综述 | 第12-24页 |
| 1.1 肝素及heparosan | 第12-14页 |
| 1.1.1 肝素 | 第12-13页 |
| 1.1.2 Heparosan | 第13-14页 |
| 1.2 大肠杆菌中乙酸生成简介 | 第14-15页 |
| 1.3 大肠杆菌敲除方法探索 | 第15-21页 |
| 1.3.1 Red同源重组 | 第15-17页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9敲除系统 | 第17-21页 |
| 1.4 细菌荚膜多糖分离纯化 | 第21-22页 |
| 1.4.1 荚膜多糖的初步分离 | 第21-22页 |
| 1.4.2 多糖的纯化 | 第22页 |
| 1.5 本文研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 E.coli K5中pta基因的敲除 | 第24-40页 |
| 2.1 前言 | 第24-25页 |
| 2.2 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.2.2 实验试剂及工具酶 | 第25-26页 |
| 2.2.3 培养基及试剂配制 | 第26-27页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第27页 |
| 2.2.5 实验所用引物 | 第27-28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-32页 |
| 2.3.1 质粒pCas, pTargetF, pKD3 的提取 | 第28-29页 |
| 2.3.2 线性打靶片段 pta-Chl-pta的制备 | 第29-30页 |
| 2.3.3 质粒pTargetF’的构建 | 第30页 |
| 2.3.4 质粒pTargetF’的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.5 pCas质粒转化入E.coli K5 | 第31页 |
| 2.3.6 E.coli K5/pCas转化子的鉴定 | 第31页 |
| 2.3.7 E.coli K5/pCas感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2.3.8 打靶片段和质粒 pTargetF’的电转化 | 第31-32页 |
| 2.3.9 重组菌株的鉴定 | 第32页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第32-38页 |
| 2.4.1 质粒pCas, pTargetF, pKD3的提取 | 第32-33页 |
| 2.4.2 E.coli K5/pCas转化子的获得 | 第33页 |
| 2.4.3 E.coli K5/pCas转化子的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.4.4 pTargetF’质粒的获取 | 第34-35页 |
| 2.4.5 pTargetF’质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| 2.4.6 线性打靶片段的制备 | 第36页 |
| 2.4.7 重组菌落的获得 | 第36-37页 |
| 2.4.8 重组子的验证 | 第37-38页 |
| 2.5 小结 | 第38-40页 |
| 第三章 E.coli K5及其△pta菌株的发酵 | 第40-52页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-42页 |
| 3.2.1 菌株 | 第40-41页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第41页 |
| 3.2.3 试剂及培养基配制 | 第41-42页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第42页 |
| 3.3 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.3.1 菌种活化与培养 | 第42-43页 |
| 3.3.2 生物量的测定 | 第43页 |
| 3.3.3 培养液中残留碳源的测定 | 第43页 |
| 3.3.4 培养液pH变化情况 | 第43页 |
| 3.3.5 Heparosan含量测定 | 第43-44页 |
| 3.3.6 乙酸含量测定 | 第44页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第44-50页 |
| 3.4.1 E.coli K5及E.coli K5 △pta菌体干重曲线 | 第44-45页 |
| 3.4.2 E.coli K5及E.coli K5 △pta生长曲线比较 | 第45-46页 |
| 3.4.3 E.coli K5及E.coli K5 △pta碳源消耗情况 | 第46-47页 |
| 3.4.4 培养液中的pH变化 | 第47页 |
| 3.4.5 培养液中heparosan含量 | 第47-48页 |
| 3.4.6 培养液中乙酸含量 | 第48-50页 |
| 3.5 小结 | 第50-52页 |
| 第四章 E.coli K5及E.coli K5 △pta荚膜多糖的分离及分析 | 第52-67页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料 | 第52-55页 |
| 4.2.1 实验试剂及仪器 | 第52-54页 |
| 4.2.2 缓冲液配制 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 荚膜多糖的初级分离 | 第55页 |
| 4.3.2 荚膜多糖纯化 | 第55-56页 |
| 4.3.3 总糖含量及 heparosan含量的测定 | 第56页 |
| 4.3.4 多糖凝胶电泳 | 第56-57页 |
| 4.3.5 凝胶渗透色谱 | 第57页 |
| 4.3.6 HPLC分析各组分中单糖组分 | 第57页 |
| 4.3.7 样品元素分析 | 第57-58页 |
| 4.3.8 傅里叶红外吸收光谱分析 | 第58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-66页 |
| 4.4.0 洗脱曲线 | 第58-59页 |
| 4.4.1 多糖凝胶电泳结果 | 第59-60页 |
| 4.4.2 凝胶渗透色谱分析 | 第60页 |
| 4.4.3 单糖组成 | 第60-64页 |
| 4.4.4 元素分析结果 | 第64页 |
| 4.4.5 傅里叶红外吸收光谱分析 | 第64-66页 |
| 4.5 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 结论与展望 | 第67-69页 |
| 5.1 结论 | 第67页 |
| 5.2 展望 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-77页 |
| 附录 | 第77-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 攻读硕士期间发表的论文 | 第80页 |
