| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-27页 |
| 1.1 肝纤维化形成过程及治疗 | 第11-18页 |
| 1.1.1 肝纤维化概况 | 第11-12页 |
| 1.1.2 肝纤维化形成过程 | 第12-14页 |
| 1.1.3 肝硬化 | 第14页 |
| 1.1.4 肝纤维化治疗方法 | 第14-18页 |
| 1.2 肝细胞生长因子 | 第18-22页 |
| 1.2.1 肝细胞生长因子结构 | 第18页 |
| 1.2.2 肝细胞生长因子受体 | 第18-20页 |
| 1.2.3 HGF治疗肝纤维化 | 第20页 |
| 1.2.4 HGF的重组表达 | 第20-21页 |
| 1.2.5 HGF的部分临床研究 | 第21-22页 |
| 1.3 中国仓鼠卵巢细胞 | 第22-25页 |
| 1.3.1 表达系统简介 | 第22页 |
| 1.3.2 CHO细胞系的发展历程 | 第22-23页 |
| 1.3.3 CHO阳性细胞株的构建 | 第23-24页 |
| 1.3.4 信号肽对CHO表达外源蛋白的影响 | 第24-25页 |
| 1.4 研究背景及研究内容 | 第25-27页 |
| 1.4.1 研究背景及立题依据 | 第25页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 肝细胞生长因子药物候选分子的设计与改造 | 第27-36页 |
| 2.1 前言 | 第27-28页 |
| 2.2 材料与方法 | 第28-31页 |
| 2.2.1 菌种、哺乳动物细胞及质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 试剂 | 第28页 |
| 2.2.3 培养基与相关溶液的配制 | 第28页 |
| 2.2.4 HGF定点突变、表达载体的构建与Pool细胞的获得 | 第28-30页 |
| 2.2.5 HSA基因与HGF(R494E)基因的融合拼接与Pool细胞的获得 | 第30页 |
| 2.2.6 HGF(R494E)与HSA-HGF(R494E)的生物学活性初步检测 | 第30-31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-35页 |
| 2.3.1 HGF基因的定点突变 | 第31页 |
| 2.3.2 Pool细胞表达HGF(R494E) 的活性检测 | 第31-33页 |
| 2.3.3 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的设计 | 第33页 |
| 2.3.4 Pool细胞表达HSA-HGF(R494E) 的活性检测 | 第33-35页 |
| 2.4 讨论 | 第35页 |
| 2.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 HGF生物学制备及突变体分子HGF(R494E)的表达 | 第36-57页 |
| 3.1 前言 | 第36-37页 |
| 3.2 材料与方法 | 第37-43页 |
| 3.2.1 菌种、哺乳动物细胞及质粒 | 第37页 |
| 3.2.2 试剂 | 第37页 |
| 3.2.3 培养基与相关溶液的配制 | 第37-38页 |
| 3.2.4 HGF在大肠杆菌中的表达 | 第38-39页 |
| 3.2.5 HGF在毕赤酵母中的表达 | 第39页 |
| 3.2.6 CHO细胞中高效分泌HGF的信号肽筛选 | 第39-41页 |
| 3.2.7 稳定表达HGF(R494E)细胞株的筛选、细胞悬浮驯化与补料分批培养 | 第41-42页 |
| 3.2.8 检测方法 | 第42页 |
| 3.2.9 HGF(R494E)的分离纯化 | 第42-43页 |
| 3.2.10 HGF(R494E)生物学活性检测 | 第43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-55页 |
| 3.3.1 HGF基因的原核表达 | 第43-44页 |
| 3.3.2 人HGF在毕赤酵母中表达 | 第44-45页 |
| 3.3.3 信号肽引导HGF表达细胞株的筛选 | 第45-47页 |
| 3.3.4 CHO细胞株的悬浮驯化及批次实验 | 第47-48页 |
| 3.3.6 不同信号肽CHO细胞的表达过程差异比较 | 第48-50页 |
| 3.3.7 不同信号肽引导表达的HGF活性检测 | 第50-51页 |
| 3.3.8 Gaussia luciferase信号肽引导HGF(R494E)细胞株的构建 | 第51页 |
| 3.3.9 HGF(R494E)的表达与纯化 | 第51-53页 |
| 3.3.10 HGF (R494E)的生物学活性检测 | 第53-55页 |
| 3.4 讨论 | 第55-56页 |
| 3.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 人血清白蛋白与HGF(R494E)融合蛋白在CHO细胞中的表达 | 第57-70页 |
| 4.1 前言 | 第57页 |
| 4.2 材料与方法 | 第57-58页 |
| 4.2.1 菌种、哺乳动物细胞、质粒以及其它细胞 | 第57页 |
| 4.2.2 试剂及仪器 | 第57-58页 |
| 4.2.3 HSA-HGF(R494E)融合基因细胞株的构建 | 第58页 |
| 4.2.4 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的分离纯化 | 第58页 |
| 4.2.5 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体外生物学活性检测 | 第58页 |
| 4.2.6 表达周期中目的基因的mRNA含量分析 | 第58页 |
| 4.2.7 表达周期中胞内目的蛋白分析 | 第58页 |
| 4.3 结果 | 第58-67页 |
| 4.3.1 构建高表达HSA-HGF(R494E)蛋白的CHO细胞株以及补料分批培养 | 第58-60页 |
| 4.3.2 表达过程中HSA-HGF(R494E)转录水平分析以及胞内蛋白表达检测 | 第60-61页 |
| 4.3.3 HSA-HGF(R494E)对其它HSA融合蛋白表达的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.4 含不同结构域的HSA与HGF(R494E)融合后在CHO中表达 | 第62-63页 |
| 4.3.5 抑制胞内降解途径显著提高HSA-HGF(R494E)蛋白在CHO中的表达 | 第63-64页 |
| 4.3.6 HSA-HGF(R494E)蛋白的分离纯化 | 第64-65页 |
| 4.3.7 HSA-HGF(R494E)的生物学活性检测-MDCK细胞离散实验 | 第65-66页 |
| 4.3.8 融合蛋白刺激L02细胞受体磷酸化以及降低HSC在纤维化标志物表达 | 第66-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-69页 |
| 4.5 本章小结 | 第69-70页 |
| 第五章 HSA-HGF(R494E)蛋白抗肝纤维化成药性初步分析 | 第70-86页 |
| 5.1 前言 | 第70-71页 |
| 5.2 材料与方法 | 第71-75页 |
| 5.2.1 实验材料与主要仪器 | 第71页 |
| 5.2.2 相关溶液的配制 | 第71页 |
| 5.2.3 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体内半衰期分析 | 第71-72页 |
| 5.2.4 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体外抗肝纤维化分析 | 第72-73页 |
| 5.2.5 动物模型的建立以及给药 | 第73页 |
| 5.2.6 实验动物处理及取材 | 第73-74页 |
| 5.2.7 制备肝组织石蜡切片 | 第74页 |
| 5.2.8 肝组织切片的HE染色 | 第74页 |
| 5.2.9 肝组织切片的Masson染色 | 第74-75页 |
| 5.2.10 血清中相关肝功能指标测定 | 第75页 |
| 5.2.11 肝组织中 α-SMA和COLⅠ基因转录水平检测 | 第75页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第75-85页 |
| 5.3.1 融合蛋白HSA-HGF(R494E)体内半衰期检测 | 第75-77页 |
| 5.3.2 融合蛋白HSA-HGF(R494E)体外抗肝纤维化分析 | 第77-79页 |
| 5.3.3 体内抗肝纤维化实验小鼠生长情况及肝脏观察 | 第79-81页 |
| 5.3.4 肝脏病理学观察 | 第81-83页 |
| 5.3.5 肝功能指标检测 | 第83-85页 |
| 5.4 本章小结 | 第85-86页 |
| 主要结论与展望 | 第86-88页 |
| 主要结论 | 第86页 |
| 展望 | 第86-88页 |
| 论文主要创新点 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-98页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第98页 |
