| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一部分 前言 | 第11-22页 |
| 1 结核病现状概述 | 第11页 |
| 2 结核病的实验室诊断方法进展 | 第11-15页 |
| ·传统的细菌学检测结核分枝杆菌 | 第11-12页 |
| ·分子生物学检测技术 | 第12-13页 |
| ·多聚酶链式反应(PCR)检测技术 | 第12页 |
| ·染色体核酸指纹法 | 第12页 |
| ·特异性核酸探针检测法 | 第12页 |
| ·基因芯片技术 | 第12-13页 |
| ·免疫学诊断技术 | 第13-15页 |
| ·结核菌素或纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验 | 第13页 |
| ·IFN-γ 检测诊断 | 第13-14页 |
| ·血清学诊断技术 | 第14页 |
| ·蛋白质芯片技术 | 第14-15页 |
| 3 结核分枝杆菌特异性抗原的研究进展 | 第15-20页 |
| ·糖脂类抗原 | 第15页 |
| ·脂阿拉伯甘露聚糖抗原(lipoarabinomannan,LAM) | 第15页 |
| ·结核菌糖类脂抗原(tuberculous glycolipid,TBGL) | 第15页 |
| ·Ag-85复合物 | 第15-16页 |
| ·38KD脂蛋白 | 第16页 |
| ·A-60抗原 | 第16-17页 |
| ·MPT63抗原(16KD抗原) | 第17页 |
| ·MPT64抗原 | 第17-18页 |
| ·早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6) | 第18页 |
| ·CFP-10 | 第18页 |
| ·PPE68 | 第18-19页 |
| ·MTB8.4 | 第19页 |
| ·MTB48 | 第19页 |
| ·小结 | 第19-20页 |
| 4. 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 5. 试验流程图 | 第21-22页 |
| 第二部分 结核分枝杆菌TB15.3与TB16.3蛋白表达载体构建、表达与纯化 | 第22-48页 |
| 1 材料与方法 | 第22-24页 |
| ·实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第22页 |
| ·主要生化试剂 | 第22页 |
| ·常用培养基、试剂、缓冲液配方 | 第22-24页 |
| ·常用培养基配方 | 第22页 |
| ·常用试剂及缓冲液配方 | 第22-24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-35页 |
| ·TB15.3与TB16.3基因特异性引物设计 | 第24页 |
| ·结核菌H37Rv DNA的提取 | 第24-25页 |
| ·结核分枝杆菌TB15.3与TB16.3抗原编码基因的克隆 | 第25-26页 |
| ·PCR扩增B15.3与TB16.3抗原基因 | 第25-26页 |
| ·PCR产物的回收 | 第26页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定 | 第26-29页 |
| ·PCR回收产物与T-载体连接 | 第26页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第27页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第28-29页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第29-30页 |
| ·带粘性末端TB15.3/16.3编码基因的制备 | 第30页 |
| ·表达载体pET-30a的制备 | 第30页 |
| ·TB15.3与TB16.3编码基因与表达载体的连接 | 第30页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第30页 |
| ·基因工程菌pET-30a- TB15.3/16.3/BL21(DE3)的构建与筛选 | 第30-31页 |
| ·pET-30a- TB15.3/TB 16.3质粒的制备 | 第30-31页 |
| ·E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第31页 |
| ·PCR筛选阳性克隆 | 第31页 |
| ·TB15.3与TB16.3抗原编码基因的诱导表达 | 第31-34页 |
| ·重组肽段SDS-PAGE分析 | 第32-33页 |
| ·最适诱导时间分析 | 第33页 |
| ·最佳诱导温度分析 | 第33页 |
| ·最适诱导剂浓度分析 | 第33页 |
| ·重组TB15.3与TB16.3肽段可溶性分析 | 第33-34页 |
| ·亲和层析分离纯化重组TB15.3/TB16.3抗原 | 第34-35页 |
| ·重组TB15.3/16.3抗原的扩大发酵 | 第34页 |
| ·亲和层析分离纯化目标抗原 | 第34页 |
| ·SDS-PAGE分析纯化组分 | 第34-35页 |
| 3. 结果与分析 | 第35-48页 |
| ·结核分枝杆菌H37Rv标准菌株的总DNA提取 | 第35页 |
| ·TB15.3/TB16.3抗原的特异性引物序列引物设计 | 第35-38页 |
| ·TB15.3编码基因及氨基酸序列 | 第35-36页 |
| ·TB16.3编码基因及氨基酸序列 | 第36页 |
| ·使用Premier Primer 5.0设计合适引物 | 第36-38页 |
| ·酶切位点的选择与引物序列的确定 | 第36-37页 |
| ·TB15.3/TB16.3抗原氨基酸序列与重组TB15.3,TB16.3抗原序列的同源性比对 | 第37-38页 |
| ·TB15.3/TB16.3编码基因扩增结果 | 第38-39页 |
| ·表达载体及克隆载体的构建及酶切鉴定结果 | 第39页 |
| ·TB15.3/TB16.3编码基因的测序鉴定结果 | 第39-41页 |
| ·TB15.3/TB16.3编码基因的诱导表达结果 | 第41-42页 |
| ·最适诱导时间分析结果 | 第42-44页 |
| ·重组TB15.3抗原诱导时间梯度表达结果 | 第42-43页 |
| ·重组TB16.3抗原诱导时间梯度表达结果 | 第43-44页 |
| ·最适诱导温度分析结果 | 第44-45页 |
| ·TB15.3温度梯度诱导分析结果 | 第44-45页 |
| ·TB16.3温度梯度诱导分析结果 | 第45页 |
| ·最适诱导剂浓度分析结果 | 第45-47页 |
| ·TB15.3抗原诱导剂浓度梯度分析结果 | 第46页 |
| ·TB16.3抗原诱导剂浓度梯度分析结果 | 第46-47页 |
| ·重组TB15.3/TB16.3肽段的可溶性分析及分离纯化结果 | 第47-48页 |
| 第三部分 重组TB15.3/TB16.3肽段ELISA检测方法的建立与血清学诊断价值评价 | 第48-51页 |
| 1 材料与方法 | 第48-49页 |
| ·实验材料 | 第48页 |
| ·重组蛋白抗原 | 第48页 |
| ·血清标本 | 第48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·缓冲液配制 | 第48页 |
| ·实验方法 | 第48-49页 |
| ·采用方阵滴定确定抗原最适包被浓度和酶标二抗最适工作浓度 | 第48-49页 |
| ·抗原包被 | 第48页 |
| ·洗涤 | 第48页 |
| ·封闭 | 第48页 |
| ·洗涤 | 第48页 |
| ·一抗反应 | 第48页 |
| ·洗涤 | 第48-49页 |
| ·二抗反应 | 第49页 |
| ·洗涤 | 第49页 |
| ·显色 | 第49页 |
| ·终止反应 | 第49页 |
| ·读数 | 第49页 |
| ·根据结果确定抗原的最适包被浓度和最适第二抗体稀释倍数 | 第49页 |
| ·ELISA检测临床标本评价3种抗原的血清学诊断价值 | 第49页 |
| 2 结果与分析 | 第49-51页 |
| ·包被抗原工作浓度的选择 | 第49页 |
| ·临床标本ELISA检测 | 第49-51页 |
| ·TB15.3抗原ELISA检测结果 | 第49页 |
| ·TB16,3蛋白抗原ELISA检测结果 | 第49-50页 |
| ·联合抗原ELISA检测结果 | 第50-51页 |
| 第四部分 讨论 | 第51-53页 |
| 1 结核分枝杆菌TB15.3与TB16.3蛋白表达载体构建 #1蛋白质表达与纯化 | 第51-52页 |
| ·引物设计与编码基因的扩增、克隆 | 第51页 |
| ·TB15.3与TB16.3抗原表达载体构建与原核表达纯化 | 第51-52页 |
| 2 重组TB15.3/TB16.3蛋白联合抗原ELISA检测方法的建立 | 第52-53页 |
| 第五部分 结论 | 第53-54页 |
| 第六部分 项目资助 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
