| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一部分 前言 | 第11-23页 |
| 1 结核病流行现状概述 | 第11页 |
| 2 预防结核病研究进展 | 第11-17页 |
| ·结核病感染免疫机制研究 | 第11-12页 |
| ·结核分枝杆菌细胞结构特点 | 第11页 |
| ·结核分枝杆菌致病机制与免疫 | 第11-12页 |
| ·结核病疫苗现状及展望 | 第12-13页 |
| ·结核病实验室诊断方法 | 第13-17页 |
| ·细菌学方法 | 第13-14页 |
| ·分子生物学方法 | 第14-16页 |
| ·免疫学方法 | 第16-17页 |
| 3 结核分枝杆菌重要诊断用抗原研究进展 | 第17-20页 |
| ·38KD脂蛋白 | 第18页 |
| ·Ag85复合物 | 第18页 |
| ·6kDa早期分泌性蛋白 | 第18-19页 |
| ·MPT64 | 第19页 |
| ·培养滤液蛋白10 | 第19-20页 |
| ·展望 | 第20页 |
| 4 本研究目的和意义 | 第20-22页 |
| 5 实验流程图 | 第22-23页 |
| 第二部分 结核分枝杆菌CFP-10、Rv2626c蛋白表达载体构建、表达与纯化 | 第23-51页 |
| 1 材料与方法 | 第23-25页 |
| ·实验材料 | 第23-25页 |
| ·菌株和质粒 | 第23页 |
| ·主要生化试剂 | 第23页 |
| ·常用培养基、试剂、缓冲液配方 | 第23-25页 |
| ·常用培养基配方 | 第23页 |
| ·常用试剂及缓冲液配方 | 第23-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| 2 实验方法 | 第25-36页 |
| ·CFP-10、Rv2626c编码基因引物设计 | 第25页 |
| ·结核菌H37Rv DNA的提取 | 第25-26页 |
| ·结核菌CFP-10、Rv2626c肽段编码基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·PCR扩增CFP-10、Rv2626c蛋白基因 | 第26页 |
| ·PCR产物的回收 | 第26-27页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定 | 第27-29页 |
| ·PCR回收产物与T-载体连接 | 第27页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第27-28页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第28-29页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第29-30页 |
| ·带粘性末端目的基因的制备 | 第29-30页 |
| ·表达载体pET-30a的制备 | 第30页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第30页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第30页 |
| ·基因工程菌pET-30a-CFP-10/BL21(DE3)、pET-30a-Rv2626c/BL21(DE3)的构建与筛选 | 第30-31页 |
| ·pET-30a-CFP-10、pET-30a-Rv2626c质粒的制备 | 第30页 |
| ·E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第30-31页 |
| ·PCR筛选阳性克隆 | 第31页 |
| ·CFP-10、Rv2626c蛋白编码基因的诱导表达 | 第31-34页 |
| ·重组肽段SDS-PAGE分析 | 第32-33页 |
| ·最适诱导时间分析 | 第33页 |
| ·最佳诱导温度分析 | 第33页 |
| ·最适诱导剂浓度分析 | 第33页 |
| ·重组CFP-10肽段与Rv2626c肽段可溶性分析 | 第33-34页 |
| ·亲和层析分离纯化重组CFP-10/Rv2626c肽段 | 第34-36页 |
| ·重组CFP-10/Rv2626c肽段的扩大发酵 | 第34页 |
| ·亲和层析分离纯化重组CFP-10/Rv2626c蛋白 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE分析纯化重组CFP-10/Rv2626c蛋白 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-51页 |
| ·CFP-10肽段、Rv2626c肽段编码基因引物设计 | 第36-39页 |
| ·CFP-10肽段编码基因 | 第36页 |
| ·Rv2626c肽段编码基因 | 第36页 |
| ·使用Premier 5.0设计合适引物 | 第36-37页 |
| ·CFP-10、Rv2626c编码基因双酶切位点的选择 | 第37页 |
| ·Non-cutters分析 | 第37页 |
| ·CFP-10/Rv2626c肽段氨基酸序列与其重组CFP-10/Rv2626c的同源性比对 | 第37-39页 |
| ·EMBL公布的目的基因序列 | 第38页 |
| ·重组肽段的编码基因序列 | 第38页 |
| ·重组肽段氨基酸序列 | 第38-39页 |
| ·Clustal X同源比对结果 | 第39页 |
| ·CFP-10/Rv2626c编码基因扩增结果 | 第39-40页 |
| ·克隆载体的构建及酶切鉴定结果 | 第40页 |
| ·CFP-10/Rv2626c编码基因的测序鉴定结果 | 第40-42页 |
| ·表达载体的构建和鉴定结果 | 第42页 |
| ·重组工程菌的菌落PCR鉴定结果 | 第42页 |
| ·CFP-10、Rv2626c编码基因的诱导表达结果 | 第42-44页 |
| ·最佳诱导温度分析结果 | 第44-45页 |
| ·CFP-10、Rv2626c编码基因的诱导表达结果 | 第45-47页 |
| ·重组CFP-10蛋白诱导时间梯度表达结果 | 第45-46页 |
| ·重组Rv2626c蛋白诱导时间梯度表达结果 | 第46-47页 |
| ·最佳诱导剂浓度分析 | 第47-49页 |
| ·重组CFP-10最佳诱导剂浓度分析 | 第47-48页 |
| ·重组Rv2626c最佳诱导剂浓度分析 | 第48-49页 |
| ·重组CFP-10/Rv2626c肽段可溶性分析 | 第49-50页 |
| ·重组CFP-10/Rv2626c肽段的分离纯化 | 第50-51页 |
| 第三部分 重组CFP-10/Rv2626c蛋白的ELISA检测方法的建立与血清学诊断价值评价 | 第51-54页 |
| 1 材料与方法 | 第51-52页 |
| ·实验材料 | 第51页 |
| ·重组蛋白抗原 | 第51页 |
| ·血清标本 | 第51页 |
| ·主要试剂 | 第51页 |
| ·缓冲液配制 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-52页 |
| ·采用方阵滴定确定抗原最适包被浓度和酶标二抗最适工作浓度 | 第51-52页 |
| ·ELISA检测临床标本评价2种抗原的血清学诊断价值并作统计分析 | 第52页 |
| 2 结果与分析 | 第52-54页 |
| ·包被抗原工作浓度的选择 | 第52页 |
| ·临床标本ELISA检测 | 第52-54页 |
| ·CFP-10抗原ELISA检测结果 | 第52页 |
| ·Rv2626c蛋白抗原ELISA检测结果 | 第52页 |
| ·联合抗原ELISA检测结果 | 第52-54页 |
| 第四部分 讨论 | 第54-57页 |
| 1 结核分枝杆菌CFP-10、Rv2626c蛋白亚表达载体构建、表达与纯化 | 第54-55页 |
| ·引物设计与编码基因的扩增、克隆 | 第54页 |
| ·CFP-10、Rv2626c表达载体构建与原核表达纯化 | 第54-55页 |
| 2 重组CFP-10、Rv2626c蛋白联合抗原ELISA检测方法的建立 | 第55-57页 |
| 第五部分 结论 | 第57-58页 |
| 资助项目 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 附录 | 第64-66页 |
