| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 英文缩略词及中文介绍 | 第8-13页 |
| 1. 前言 | 第13-29页 |
| 1.1 金针菇的研究进展 | 第13-18页 |
| 1.1.1 金针菇生长发育的营养条件 | 第13-14页 |
| 1.1.2 金针菇生长发育环境条件 | 第14-15页 |
| 1.1.3 金针菇生长发育机理研究进展 | 第15-17页 |
| 1.1.4 真菌的双组份系统 | 第17页 |
| 1.1.5 真菌的cAMP信号转导途径 | 第17-18页 |
| 1.2 MADS-box的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.2.1 MADS-box的结构和分类 | 第18页 |
| 1.2.2 MADS-box的生物学功能 | 第18-19页 |
| 1.3 CRISPR/Cas的研究进展 | 第19-26页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的发现历程 | 第19-20页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的结构和分类 | 第20-21页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9系统的作用机理 | 第21-22页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第22-25页 |
| 1.3.5 CRISPR/Cas系统的优点和存在的问题 | 第25-26页 |
| 1.3.5.1 CRISPR/Cas系统的优点 | 第25页 |
| 1.3.5.2 CRISPR/Cas9系统的不足 | 第25-26页 |
| 1.3.5.3 CRISPR/Cas9系统的改进方法 | 第26页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 1.5 本研究的技术路线 | 第28-29页 |
| 2. 材料与方法 | 第29-51页 |
| 2.1 材料 | 第29-34页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第29页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第29-30页 |
| 2.1.3 培养基和和试剂的配制 | 第30-32页 |
| 2.1.4 引物 | 第32-33页 |
| 2.1.5 工具酶 | 第33-34页 |
| 2.1.6 试剂盒 | 第34页 |
| 2.2 方法 | 第34-51页 |
| 2.2.1 转录组原材料的收集和测序 | 第34-35页 |
| 2.2.2 菌丝和原基转录组数据的分析、差异表达文库的构建和基因的筛选 | 第35页 |
| 2.2.3 金针菇Fv-Yx单核体的筛选和出菇实验 | 第35-36页 |
| 2.2.3.1 金针菇原生质体的制备与再生 | 第35页 |
| 2.2.3.2 单菌落的挑取与镜检 | 第35-36页 |
| 2.2.3.3 单核体的出菇验证试验 | 第36页 |
| 2.2.4 金针菇单核体菌丝和原生质体对潮霉素的浓度敏感实验 | 第36页 |
| 2.2.4.1 金针菇单核体菌丝对潮霉素（HmB）的最低敏感浓度检测 | 第36页 |
| 2.2.4.2 金针菇单核体原生质体对潮霉素（HmB）的最低敏感浓度检测 | 第36页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第36-38页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的鉴定 | 第37页 |
| 2.2.5.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第37页 |
| 2.2.5.4 大肠杆菌质粒的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.6 金针菇菌丝和原基差异表达基因基因的克隆 | 第38-42页 |
| 2.2.6.1 金针菇RNA的提取和反转录cDNA的合成 | 第38-40页 |
| 2.2.6.2 差异表达基因的克隆 | 第40-41页 |
| 2.2.6.3 PCR产物检测 | 第41页 |
| 2.2.6.4 PCR产物纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.6.5 PCR产物的测序 | 第42页 |
| 2.2.7 Mads8、N1477、HK535基因gRNA载体的构建 | 第42-45页 |
| 2.2.7.1 启动子H1片段（249 bp）的克隆 | 第42-43页 |
| 2.2.7.2 gRNA片段（118 bp）的克隆 | 第43页 |
| 2.2.7.3 潮霉素完整表达框（2227 bp）的克隆 | 第43页 |
| 2.2.7.4 降落重叠衍伸PCR片段融合 | 第43-44页 |
| 2.2.7.5 gRNA表达框架与pMD18-T载体连接 | 第44-45页 |
| 2.2.8 Mads8和HK535重组载体的构建 | 第45-48页 |
| 2.2.8.1 gRNA表达框的PCR克隆 | 第45页 |
| 2.2.8.2 gRNA表达框和载体酶切 | 第45-46页 |
| 2.2.8.3 gRNA表达框和载体片段的连接 | 第46-47页 |
| 2.2.8.4 载体的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 2.2.9 PEG介导的金针菇原生质体转化 | 第48页 |
| 2.2.10 拟转化子的筛选与鉴定 | 第48-51页 |
| 2.2.10.1 拟转化子基因组DNA的提取 | 第49页 |
| 2.2.10.2 拟转化子的PCR鉴定和T7核酸内切酶 | 第49-51页 |
| 3. 结果与分析 | 第51-71页 |
| 3.1 金针菇转录组材料的收集和测序结果分析 | 第51-52页 |
| 3.1.1 金针菇转录组材料的收集 | 第51页 |
| 3.1.2 转录组数据的分析 | 第51-52页 |
| 3.2 差异表达基因转录组数据库比对结果 | 第52-53页 |
| 3.3 金针菇单核体出菇实验 | 第53-54页 |
| 3.4 金针菇单核体Fy74对潮霉素浓度的敏感性测定 | 第54-56页 |
| 3.4.1 Fy74菌丝对潮霉素浓度的敏感性实验 | 第54-55页 |
| 3.4.2 金针菇单核体Fy74原生质体对潮霉素浓度的敏感性实验 | 第55-56页 |
| 3.5 差异基因gRNA载体的构建 | 第56-61页 |
| 3.5.1 金针菇单核体Fy74总RNA的提取和cDNA合成 | 第56页 |
| 3.5.2 pgRNA-Mads8载体的构建 | 第56-59页 |
| 3.5.2.1 Mads8基因的克隆 | 第56-57页 |
| 3.5.2.2 Mads8基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆 | 第57-58页 |
| 3.5.2.3 Mads8基因gRNA载体片段的融合 | 第58-59页 |
| 3.5.3 pgRNA-N1477载体的构建 | 第59-60页 |
| 3.5.3.1 N1477基因的克隆 | 第59页 |
| 3.5.3.2 N1477基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆 | 第59页 |
| 3.5.3.3 N1477基因gRNA载体片段的融合 | 第59-60页 |
| 3.5.4 pgRNA-HK535载体的构建 | 第60-61页 |
| 3.5.4.1 HK535基因靶位点序列的选取和gRNA载体片段的克隆 | 第60页 |
| 3.5.4.2 HK535基因gRNA载体片段的融合 | 第60-61页 |
| 3.6 重组载体的构建 | 第61-63页 |
| 3.6.1 H1-gRNA-hph片段的克隆 | 第61-62页 |
| 3.6.2 重组载体的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第62-63页 |
| 3.7 PEG介导的金针菇原生质体转化 | 第63-65页 |
| 3.7.1 PEG介导的金针菇原生质体共转化 | 第63-64页 |
| 3.7.2 PEG介导的金针菇原生质体单转化 | 第64-65页 |
| 3.8 拟转化子的筛选和鉴定 | 第65-71页 |
| 3.8.1 拟转化子的筛选 | 第65-66页 |
| 3.8.2 拟转化子基因组DNA的提取 | 第66-67页 |
| 3.8.3 双质粒共转化拟转化子的鉴定 | 第67-69页 |
| 3.8.4 重组质粒单转化拟转化子的鉴定 | 第69-71页 |
| 4. 讨论与结论 | 第71-77页 |
| 4.1 讨论 | 第71-75页 |
| 4.1.1 金针菇CRISPR/Cas9系统构建载体的策略 | 第71-72页 |
| 4.1.2 CRISPR/Cas9基因敲除效率探讨 | 第72-73页 |
| 4.1.3 单核体制备和PEG介导的金针菇原生质体转化效率的影响因素 | 第73-75页 |
| 4.1.4 筛选标记基因的选择 | 第75页 |
| 4.2 全文结论 | 第75-76页 |
| 4.3 本研究的创新之处 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 附录 | 第87-91页 |
