| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-24页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第13-16页 |
| 1.1.1 脂肪酶的定义 | 第13-14页 |
| 1.1.2 脂肪酶的理化性质 | 第14-15页 |
| 1.1.3 脂肪酶的应用 | 第15-16页 |
| 1.2 从分子水平提高基因工程菌表达量的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.1 密码子的偏爱性 | 第16页 |
| 1.2.2 基因拷贝数 | 第16页 |
| 1.2.3 基因启动子和信号肽 | 第16-17页 |
| 1.2.4 糖基化修饰 | 第17页 |
| 1.3 毕赤酵母高密度发酵条件的控制 | 第17-20页 |
| 1.3.1 溶氧的控制 | 第17-18页 |
| 1.3.2 温度的控制 | 第18页 |
| 1.3.3 pH的控制 | 第18-19页 |
| 1.3.4 补料方式的控制 | 第19页 |
| 1.3.5 甲醇浓度的控制 | 第19页 |
| 1.3.6 双碳源混合流加策略 | 第19-20页 |
| 1.4 分子伴侣在毕赤酵母表达系统中的应用 | 第20-22页 |
| 1.4.1 分子伴侣简介 | 第20页 |
| 1.4.2 分子伴侣的作用机制 | 第20-21页 |
| 1.4.3 分子伴侣在基因工程菌中的应用 | 第21-22页 |
| 1.5 立题意义及研究内容 | 第22-24页 |
| 1.5.1 立题意义 | 第22-23页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第23页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 脂肪酶MAS1的克隆表达与纯化 | 第24-36页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料和仪器 | 第24-27页 |
| 2.2.1 菌株与载体 | 第24页 |
| 2.2.2 试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.3 培养基的配制 | 第25页 |
| 2.2.4 缓冲液的配制 | 第25-27页 |
| 2.2.5 实验仪器 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-33页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第27页 |
| 2.3.2 表达载体pPICZαA-MAS1的构建 | 第27-30页 |
| 2.3.3 重组菌株MAS1-pPICZαA/X33的获得 | 第30-32页 |
| 2.3.4 重组菌株MAS1-pPICZαA/X33的扩大培养 | 第32页 |
| 2.3.5 脂肪酶MAS1的分离纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.6 脂肪酶酶活的测定 | 第33页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第33-35页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第33页 |
| 2.4.2 表达载体pPICZaA-MAS1(his)的构建 | 第33-34页 |
| 2.4.3 重组菌株MAS1-pPICZαA/X33的表达 | 第34-35页 |
| 2.4.4 目的蛋白的分离纯化 | 第35页 |
| 2.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 重组菌株高密度发酵条件的优化 | 第36-46页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验材料和仪器 | 第36-38页 |
| 3.2.1 实验菌株 | 第36页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 3.2.3 培养基及溶液的配制 | 第37页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第37-38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-41页 |
| 3.3.1 种子液的制备 | 第38页 |
| 3.3.2 高密度发酵的控制 | 第38-40页 |
| 3.3.3 诱导温度的优化 | 第40页 |
| 3.3.4 诱导p H的优化 | 第40页 |
| 3.3.5 双碳源混合流加 | 第40页 |
| 3.3.6 脂肪酶酶活，总蛋白含量，细胞活性以及菌体湿重的测定 | 第40-41页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第41-45页 |
| 3.4.1 诱导温度的优化 | 第41-42页 |
| 3.4.2 诱导pH的优化 | 第42-44页 |
| 3.4.3 双碳源混合流加 | 第44-45页 |
| 3.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第四章 分子伴侣对MAS1表达量影响的研究 | 第46-56页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 实验材料和仪器 | 第46-48页 |
| 4.2.1 菌株与载体 | 第46页 |
| 4.2.2 试剂 | 第46-47页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第47-48页 |
| 4.3 试验方法 | 第48-53页 |
| 4.3.1 引物合成 | 第48页 |
| 4.3.2 表达载体pPIC9K-HAC1/Bip/PDI/VHB的构建 | 第48-52页 |
| 4.3.3 重组质粒电击转化MAS1-pPiCZaA/X33酵母感受态细胞 | 第52页 |
| 4.3.4 分子伴侣与MAS1共表达重组菌株的鉴定 | 第52页 |
| 4.3.5 重组毕赤酵母菌的高密度发酵 | 第52-53页 |
| 4.4 试验结果与讨论 | 第53-55页 |
| 4.4.1 引物设计 | 第53页 |
| 4.4.2 表达载体pPIC9K- HAC1/Bip/PDI/VHB的构建 | 第53-54页 |
| 4.4.3 分子伴侣与MAS1共表达酵母菌的鉴定 | 第54页 |
| 4.4.4 分子伴侣与MAS1共表达菌株的高密度发酵 | 第54-55页 |
| 4.5 本章小结 | 第55-56页 |
| 第五章 脂肪酶MAS1的酶学性质研究 | 第56-65页 |
| 5.1 引言 | 第56页 |
| 5.2 实验材料和仪器 | 第56-57页 |
| 5.2.1 试剂 | 第56页 |
| 5.2.2 缓冲液的配置 | 第56-57页 |
| 5.2.3 实验仪器 | 第57页 |
| 5.3 实验方法 | 第57-59页 |
| 5.3.1 最适温度及温度稳定性测定 | 第57-58页 |
| 5.3.2 最适pH及pH稳定性测定 | 第58页 |
| 5.3.3 最适底物的测定 | 第58页 |
| 5.3.4 金属离子、表面活性剂以及有机溶剂对酶活力的影响 | 第58页 |
| 5.3.5 MAS1对TAG和DAG的水解特性 | 第58-59页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第59-64页 |
| 5.4.1 最适温度及温度稳定性 | 第59-60页 |
| 5.4.2 最适pH及pH稳定性 | 第60-61页 |
| 5.4.3 底物选择性 | 第61-62页 |
| 5.4.4 不同金属离子对MAS1酶活力的影响 | 第62-63页 |
| 5.4.5 不同的表面活性剂和有机溶剂对MAS1酶活力的影响 | 第63-64页 |
| 5.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 结论与展望 | 第65-66页 |
| 结论 | 第65页 |
| 创新点 | 第65页 |
| 展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 附录 | 第72-75页 |
| 附录1：本文研究的分子伴侣基因序列 | 第72-74页 |
| 附录2： 脂肪酶MAS1水解TAG/DAG产物成分及含量的测定结果 | 第74-75页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 | 第77页 |
