| Abstract | 第8-12页 |
| Abbreviations | 第13-14页 |
| 1 Introduction | 第14-49页 |
| 1.1 Archaea as the third domain of life | 第14-17页 |
| 1.1.1 Sulfolobus | 第16-17页 |
| 1.2 Types of DNA lesions and DNA repair | 第17-22页 |
| 1.2.1 Types of DNA lesions | 第17-18页 |
| 1.2.2 Types of DNA repair | 第18-21页 |
| 1.2.3 DNA repair in archaea | 第21-22页 |
| 1.3 The HRR pathways and helicase-nuclease complexes | 第22-39页 |
| 1.3.1 The HRR pathways in bacteria | 第22-28页 |
| 1.3.1.1 The RecBCD pathway | 第23-25页 |
| 1.3.1.2 The RecFOR pathway | 第25页 |
| 1.3.1.3 The SbcC-SbcD pathway | 第25页 |
| 1.3.1.4 The RecE-RecT pathway | 第25-26页 |
| 1.3.1.5 Two other helicase-nuclease complexes for dsDNA end resection-AddABand AdnAB | 第26-28页 |
| 1.3.2 The HRR pathway in eukaryotes | 第28-35页 |
| 1.3.3 The HRR pathway in archaea | 第35-39页 |
| 1.4 Brief summary of Archaeal genetic systems | 第39-47页 |
| 1.4.1 The development of Sulfolobus genetic systems | 第40-47页 |
| 1.4.1.1 Transformation methods | 第40-41页 |
| 1.4.1.2 Selectable markers | 第41-43页 |
| 1.4.1.3 Recipient strains | 第43页 |
| 1.4.1.4 Shuttle vectors | 第43-45页 |
| 1.4.1.5 Reporter genes and promoters | 第45页 |
| 1.4.1.6 Gene knockout strategies | 第45-47页 |
| 1.5 The aims of the project | 第47-49页 |
| 2 The essentiality of HRR genes, herA,mre11,rad50, and nurA,and the conserved residues ofHerA and NurA proteins in Sulfolobus islandicus | 第49-63页 |
| 2.1 Materials and Methods | 第49-54页 |
| 2.1.1 Strains and plasmids | 第49-50页 |
| 2.1.2 Main reagents and instruments | 第50页 |
| 2.1.3 Formulae of main media and solutions | 第50页 |
| 2.1.4 Isolation of S. islandicus genomic DNA | 第50页 |
| 2.1.5 Preparation of E.coli and Sulfolobus competent cells | 第50页 |
| 2.1.6 Construction of pSSR plasmids containing wild type or mutant herA and nurA forthe genetic complementation assay | 第50-52页 |
| 2.1.6.1 Construction of complementation plasmids for herA and its mutant | 第50-51页 |
| 2.1.6.2 Construction of complementation plasmids for nurA and its mutant | 第51-52页 |
| 2.1.7 Transformation of E. coli and Sulfolobus | 第52页 |
| 2.1.7.1 Transformation of E.coli | 第52页 |
| 2.1.7.2 Transformation of Sulfolobus | 第52页 |
| 2.1.8 Mutant propagation assay for analyzing gene essentiality | 第52-53页 |
| 2.1.9 Genotype verification of the HerA and NurA complementation strains by PCR andsequencing | 第53-54页 |
| 2.1.9.1 Genotype verification of the HerA complementation strains | 第53-54页 |
| 2.1.9.2 Genotype verification of the NurA complementation strains | 第54页 |
| 2.2 Results and discussion | 第54-62页 |
| 2.2.1 The essentiality of herA,mre11, rad50, and nurA | 第54-55页 |
| 2.2.2 Construction of HerA and NurA complementation plasmids | 第55-56页 |
| 2.2.3 Genotype verification of the HerA complementation strains | 第56-59页 |
| 2.2.4 Genotype verification of the NurA complementation strains | 第59-62页 |
| 2.3 Summary | 第62-63页 |
| 3 Biochemical characterization of HerA,NurA and their mutants | 第63-80页 |
| 3.1 Materials and Methods | 第63-68页 |
| 3.1.1 Strains and plasmids | 第63页 |
| 3.1.2 Main reagents, instruments, media, and solutions | 第63页 |
| 3.1.3 Construction of heterologous expression plasmids | 第63-64页 |
| 3.1.3.1 Construction of heterologous expression plasmids for HerA and its mutants | 第63-64页 |
| 3.1.3.2 Construction of heterologous expression plasmids for NurA and its mutants | 第64页 |
| 3.1.4 Protein purification | 第64-65页 |
| 3.1.4.1 Purification of HerA and its mutants | 第64-65页 |
| 3.1.4.2 Purification of NurA and its mutants | 第65页 |
| 3.1.5 Preparation of DNA substrates for the DNA degradation assays | 第65-67页 |
| 3.1.5.1 Synthesis of oligonucleotids | 第65-66页 |
| 3.1.5.2 Preparation of DNA substrates | 第66-67页 |
| 3.1.6 ATPase activity assay | 第67页 |
| 3.1.6.1 The principle of ATPase activity assay | 第67页 |
| 3.1.6.2 The procedure of ATPase activity assay | 第67页 |
| 3.1.7 The DNA degradation assay of HerA-NurA | 第67-68页 |
| 3.1.8 Analysis of the interaction between HerA and NurA mutants | 第68页 |
| 3.1.9 Western blot analysis | 第68页 |
| 3.2 Results and discussion | 第68-78页 |
| 3.2.1 Construction of expression plasmids for HerA and NurA and protein purification | 第68-70页 |
| 3.2.2 ATPase activity assay of HerA mutants | 第70-72页 |
| 3.2.3 The DNA degradation assay of HerA-NurA | 第72-77页 |
| 3.2.4 Analysis of the interaction between HerA and NurA mutants | 第77-78页 |
| 3.3 Summary | 第78-80页 |
| 4 Immunofluorescence analysis of HRR proteins | 第80-87页 |
| 4.1 Materials and Methods | 第80-81页 |
| 4.1.1 Strains and plasmids | 第80页 |
| 4.1.2 Main reagents, instruments, media, and solutions | 第80页 |
| 4.1.3 Immunofluorescence assay | 第80-81页 |
| 4.2 Results and discussion | 第81-86页 |
| 4.2.1 The foci formation of HerA under normal condition | 第81-82页 |
| 4.2.2 HerA foci formation after UV treatment | 第82-83页 |
| 4.2.3 NurA foci formation under the physiological growth conditions and after UVtreatment | 第83-84页 |
| 4.2.4 RadA foci formation in UV-irradiated or normal cells | 第84-86页 |
| 4.3 Summary | 第86-87页 |
| 5 Study on HerA overexpression in S. islandicus | 第87-107页 |
| 5.1 Materials and Methods | 第87-93页 |
| 5.1.1 Strains and plasmids | 第87页 |
| 5.1.2 Main reagents, instruments, media and solutions | 第87-88页 |
| 5.1.3 Construction of the plasmids for HerA overexpression | 第88页 |
| 5.1.4 Construction of different HerA overexpression strains | 第88-89页 |
| 5.1.5 Detection of HerA expression levels in cells by Western blot | 第89页 |
| 5.1.6 Protein Purification | 第89-90页 |
| 5.1.7 Phenotype analyses of HerA overexpression strain | 第90-93页 |
| 5.1.7.1 Determination of the growth and survival ratio (colony formation unit,CFU) | 第90页 |
| 5.1.7.2 Microscopy analysis | 第90-91页 |
| 5.1.7.3 Flow cytometry | 第91页 |
| 5.1.7.4 Assay of the sensitivity to DNA damaging agents | 第91页 |
| 5.1.7.5 Microarray analysis | 第91-93页 |
| 5.2 Results and discussion | 第93-105页 |
| 5.2.1 Construction of different HerA overexpression strains | 第93-96页 |
| 5.2.2 The survival rate of HerA overexpression strain | 第96-97页 |
| 5.2.3 Microscopy and flow cytometry analysis | 第97-100页 |
| 5.2.4 Analysis of the sensitivity to DNA damaging agents | 第100-104页 |
| 5.2.5 Microarray analysis | 第104-105页 |
| 5.3 Summary | 第105-107页 |
| 6 Analyses of HerA-interacting proteins in vivo | 第107-116页 |
| 6.1 Materials and Methods | 第107-110页 |
| 6.1.1 Strains and plasmids | 第107页 |
| 6.1.2 Main reagents, instruments, media and solutions | 第107页 |
| 6.1.3 Construction of a plasmid for the addition of a His-tag-coding sequence to 5'endof chromosomal herA (in situ His-tagged) | 第107-108页 |
| 6.1.4 Construction and verification of a strain encoding an in situ N-His-tagged HerA(pMIDHis-herA-T) | 第108页 |
| 6.1.5 Protein purification | 第108-109页 |
| 6.1.5.1 Purification of HerA from the strain pMIDHis-herA-T | 第108-109页 |
| 6.1.5.2 Purification of the ATPase and Hjc from E. coli | 第109页 |
| 6.1.6 Identification of HerA interacting proteins | 第109-110页 |
| 6.1.7 Analysis of the interaction of HerA with the ATPase or Hjc by pull-down assay | 第110页 |
| 6.2 Results and discussion | 第110-114页 |
| 6.2.1 Construction and identification of pMIDHis-herA-T | 第110-111页 |
| 6.2.2 Purification of the in situ His-tagged HerA | 第111-112页 |
| 6.2.3 Identification of HerA interacting proteins | 第112-114页 |
| 6.3 Summary | 第114-116页 |
| 7 Conclusion and prospect | 第116-121页 |
| 7.1 Conclusion | 第116-118页 |
| 7.2 Prospect | 第118-121页 |
| Appendix | 第121-139页 |
| Appendix Ⅰ-Reagents | 第121-122页 |
| Appendix Ⅱ-Instruments | 第122-124页 |
| Appendix Ⅲ-Media | 第124-126页 |
| Appendix Ⅳ-Solutions | 第126-127页 |
| Appendix Ⅴ-Making E. coli competent cells by CaCl_2 | 第127-128页 |
| Appendix Ⅵ-Systems for PCR, double digestion and ligation | 第128-130页 |
| Appendix Ⅶ-SOE PCR | 第130-132页 |
| Appendix Ⅷ-Gel Extraction Kit for recycling DNA | 第132-133页 |
| Appendix Ⅷ-Plasmid Mini Kit for plasmid extraction | 第133-134页 |
| Appendix Ⅹ-Transformation of S. islandicus cells | 第134-135页 |
| Appendix Ⅺ-Extraction of Sulfolobus genomic DNA | 第135-136页 |
| Appendix Ⅻ-Western blot assay | 第136-137页 |
| Appendix ⅩⅢ-The sequences of oligonucleotides used in this study | 第137-139页 |
| References | 第139-153页 |
| Acknowledgement | 第153-155页 |
| Published paper | 第155-156页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第156-157页 |
| 附件 | 第157-170页 |
