| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第8-18页 |
| 1.1 丝状真菌蛋白表达系统的研究现状 | 第8-14页 |
| 1.1.1 丝状真菌在表达重组蛋白中的应用 | 第8-9页 |
| 1.1.2 影响丝状真菌重组蛋白表达的因素 | 第9-11页 |
| 1.1.3 提高丝状真菌蛋白表达和分泌的策略 | 第11-14页 |
| 1.2 粗糙脉孢菌 | 第14-16页 |
| 1.2.1 粗糙脉孢菌的概述 | 第14-15页 |
| 1.2.2 粗糙脉孢菌蛋白表达系统的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.3 课题立项依据及目的意义 | 第16-17页 |
| 1.3.1 课题立项依据 | 第16-17页 |
| 1.3.2 研究意义 | 第17页 |
| 1.4 研究内容 | 第17-18页 |
| 2 材料与方法 | 第18-33页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-21页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3 实验用菌株、质粒和引物 | 第20-21页 |
| 2.2 常用培养基和缓冲液的配制 | 第21-24页 |
| 2.2.1 常用缓冲液的配制 | 第22-24页 |
| 2.2.2 常用培养基的配制 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-33页 |
| 2.3.1 PCR扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.2 PCR产物纯化(QIAGEN纯化试剂盒) | 第25-26页 |
| 2.3.3 琼脂糖凝胶回收DNA片段(试剂盒) | 第26页 |
| 2.3.4 限制性内切酶酶切 | 第26-27页 |
| 2.3.5 片段和载体连接 | 第27页 |
| 2.3.6 E.coli Top 10感受态细胞转化 | 第27页 |
| 2.3.7 大肠杆菌质粒提取(质粒小提试剂盒) | 第27-28页 |
| 2.3.8 分生孢子的制备 | 第28页 |
| 2.3.9 N.crassa电击转化 | 第28页 |
| 2.3.10 N.crassa基因组提取 | 第28-29页 |
| 2.3.11 真菌杂交构建表达宿主菌株 | 第29页 |
| 2.3.12 重组蛋白诱导表达和蛋白浓度测定 | 第29页 |
| 2.3.13 酶活测定 | 第29-30页 |
| 2.3.14 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第30页 |
| 2.3.15 Western Blotting实验流程 | 第30-31页 |
| 2.3.16 重组蛋白的分离纯化 | 第31-32页 |
| 2.3.17 酶特性分析 | 第32-33页 |
| 3 结果与讨论 | 第33-55页 |
| 3.1 表达载体的构建 | 第33-38页 |
| 3.1.1 构建质粒pccg1-THG | 第33页 |
| 3.1.2 选择强启动子 | 第33-35页 |
| 3.1.3 选择高表达的目的基因 | 第35-38页 |
| 3.2 表达宿主菌的构建 | 第38-44页 |
| 3.2.1 3ΔβG表型验证 | 第38-40页 |
| 3.2.2 3ΔβG和Δ2cbhΔhis3进行杂交 | 第40-42页 |
| 3.2.3 表达宿主菌表型分析 | 第42-44页 |
| 3.3 N.crassa阳性转化子的筛选 | 第44-46页 |
| 3.3.1 组氨酸缺陷型为筛选标记 | 第44页 |
| 3.3.2 绿色荧光蛋白(GFP)筛选 | 第44-46页 |
| 3.4 重组蛋白GH3-4和CBH-1的表达和纯化 | 第46-49页 |
| 3.4.1 重组蛋白GH3-4和CBH-1的表达 | 第46-48页 |
| 3.4.2 重组蛋白GH3-4和CBH-1的分离纯化 | 第48-49页 |
| 3.5 重组蛋白GH3-4和CBH-1的酶特性分析 | 第49-52页 |
| 3.5.1 温度和酸碱度对酶活力的影响 | 第49-50页 |
| 3.5.2 酸碱度和热稳定性对酶活力的影响 | 第50-51页 |
| 3.5.3 底物专一性对酶活力的影响 | 第51页 |
| 3.5.4 金属离子和螯合剂对酶活力的影响 | 第51-52页 |
| 3.6 讨论 | 第52-55页 |
| 4 结论 | 第55-57页 |
| 5 展望 | 第57-58页 |
| 6 参考文献 | 第58-65页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第65-66页 |
| 8 致谢 | 第66页 |
