| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 主要符号表 | 第24-25页 |
| 1 绪论 | 第25-44页 |
| 1.1 引言 | 第25页 |
| 1.2 芽孢杆菌的概况 | 第25-26页 |
| 1.2.1 芽孢杆菌的特性 | 第25页 |
| 1.2.2 芽孢杆菌的用途 | 第25-26页 |
| 1.3 丁二酮概述 | 第26-29页 |
| 1.3.1 丁二酮的理化性质 | 第26页 |
| 1.3.2 丁二酮的用途 | 第26-27页 |
| 1.3.3 丁二酮的制备方法 | 第27-28页 |
| 1.3.4 丁二酮的检测方法 | 第28-29页 |
| 1.4 微生物法合成丁二酮的代谢途径 | 第29-31页 |
| 1.4.1 丁二酮的生产菌株 | 第29-30页 |
| 1.4.2 丁二酮的代谢途径 | 第30-31页 |
| 1.5 丁二酮代谢途径关键酶BDH的概述 | 第31-33页 |
| 1.5.1 BDH的理化性质 | 第31-32页 |
| 1.5.2 BDH的结构研究 | 第32-33页 |
| 1.6 蛋白质结构和功能的研究技术 | 第33-36页 |
| 1.6.1 圆二色谱在蛋白质结构研究中的应用 | 第33-36页 |
| 1.6.2 同源建模在蛋白质结构研究中的应用 | 第36页 |
| 1.7 提高微生物合成丁二酮的主要策略 | 第36-43页 |
| 1.7.1 菌种改良 | 第37-40页 |
| 1.7.2 培养基组分优化 | 第40-41页 |
| 1.7.3 发酵环境条件优化 | 第41-42页 |
| 1.7.4 金属离子促进α-乙酰乳酸非酶氧化为丁二酮 | 第42-43页 |
| 1.8 本课题研究的意义和内容 | 第43-44页 |
| 1.8.1 本课题研究的意义 | 第43页 |
| 1.8.2 本课题研究的内容 | 第43-44页 |
| 2 丁二酮代谢关键酶BDH的表征 | 第44-73页 |
| 2.1 引言 | 第44页 |
| 2.2 实验材料 | 第44-47页 |
| 2.2.1 实验仪器与设备 | 第44-45页 |
| 2.2.2 酶和试剂 | 第45-46页 |
| 2.2.3 菌株和质粒 | 第46页 |
| 2.2.4 PCR引物 | 第46-47页 |
| 2.2.5 培养基和试剂的配置 | 第47页 |
| 2.3 实验方法 | 第47-53页 |
| 2.3.1 B.sp.DL01的鉴定 | 第47页 |
| 2.3.2 budC的克隆 | 第47-48页 |
| 2.3.3 BDH的表达和纯化 | 第48页 |
| 2.3.4 BDH分子量的测定 | 第48-49页 |
| 2.3.5 BDH的活性分析 | 第49页 |
| 2.3.6 BDH的酶学性质分析 | 第49页 |
| 2.3.7 BDH的动力学参数分析 | 第49-50页 |
| 2.3.8 BDH的热力学及结构分析 | 第50页 |
| 2.3.9 B.sp.DL01重组表达BDH | 第50-53页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第53-71页 |
| 2.4.1 B.sp.DL01的表征 | 第53-54页 |
| 2.4.2 D194G-BDH的序列分析 | 第54-55页 |
| 2.4.3 BDH的表达和纯化 | 第55-56页 |
| 2.4.4 BDH的分子量 | 第56-58页 |
| 2.4.5 BDH的底物和辅酶特异性 | 第58-59页 |
| 2.4.6 pH和温度对BDH酶活力的影响 | 第59-60页 |
| 2.4.7 BDH的酶催化反应动力学 | 第60-61页 |
| 2.4.8 CD光谱分析BDH的二级结构 | 第61-64页 |
| 2.4.9 D194G-BDH的native-PAGE和胰酶消化 | 第64-66页 |
| 2.4.10 D194G-BDH的结构分析 | 第66页 |
| 2.4.11 重组表达BDH对B.sp.DL01发酵的影响 | 第66-71页 |
| 2.5 本章小结 | 第71-73页 |
| 3 阻断B.sp.DL01丁二酮代谢副产物乙偶姻的形成 | 第73-94页 |
| 3.1 引言 | 第73页 |
| 3.2 实验材料 | 第73-76页 |
| 3.2.1 实验仪器与设备 | 第73-74页 |
| 3.2.2 酶和试剂 | 第74页 |
| 3.2.3 溶液的配制 | 第74页 |
| 3.2.4 菌株和质粒 | 第74-75页 |
| 3.2.5 PCR引物 | 第75页 |
| 3.2.6 培养基 | 第75-76页 |
| 3.3 实验方法 | 第76-81页 |
| 3.3.1 B.sp.DL01的耐药性分析 | 第76页 |
| 3.3.2 alsD基因上下游片段的扩增 | 第76页 |
| 3.3.3 alsD敲除片段的构建 | 第76-77页 |
| 3.3.4 B.sp.DL01感受态细胞的制备 | 第77页 |
| 3.3.5 alsD敲除片段电转化B.sp.DL01感受态细胞 | 第77页 |
| 3.3.6 敲除ALDC菌株的PCR验证 | 第77-78页 |
| 3.3.7 ALDC的酶活测定 | 第78-79页 |
| 3.3.8 菌体生长曲线的绘制 | 第79页 |
| 3.3.9 底物葡萄糖浓度的测定 | 第79页 |
| 3.3.10 GC-MS定性分析发酵产物丁二酮 | 第79页 |
| 3.3.11 发酵产物浓度的测定 | 第79-80页 |
| 3.3.12 发酵液中α-乙酰乳酸的检测 | 第80页 |
| 3.3.13 统计学分析 | 第80-81页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第81-93页 |
| 3.4.1 B.sp.DL01的耐药性分析 | 第81页 |
| 3.4.2 alsD基因上下游片段的扩增及鉴定 | 第81-82页 |
| 3.4.3 重组alsD敲除片段的获得 | 第82-83页 |
| 3.4.4 敲除菌株B.sp.DL01-⊿alsD的筛选及验证 | 第83-86页 |
| 3.4.5 ALDC酶活分析 | 第86-87页 |
| 3.4.6 B.sp.DL01-⊿alsD的生长曲线特征 | 第87-88页 |
| 3.4.7 B.sp.DL01-⊿alsD的葡萄糖消耗曲线特征 | 第88-89页 |
| 3.4.8 ALDC敲除对B.sp.DL01发酵的影响 | 第89-93页 |
| 3.5 本章小结 | 第93-94页 |
| 4 B.sp.DL01丁二酮合成途径代谢流的调控 | 第94-108页 |
| 4.1 引言 | 第94页 |
| 4.2 实验材料 | 第94-96页 |
| 4.2.1 实验仪器与设备 | 第94-95页 |
| 4.2.2 酶和试剂 | 第95页 |
| 4.2.3 溶液的配制 | 第95页 |
| 4.2.4 菌株和质粒 | 第95-96页 |
| 4.2.5 PCR引物 | 第96页 |
| 4.2.6 培养基 | 第96页 |
| 4.3 实验方法 | 第96-98页 |
| 4.3.1 alsS启动子的选择 | 第96页 |
| 4.3.2 PCR扩增alsS及其启动子序列 | 第96-97页 |
| 4.3.3 构建重组质粒pHY300PLK-alsS | 第97页 |
| 4.3.4 构建重组菌株B.sp.DL01-⊿alsD-alsS | 第97页 |
| 4.3.5 ALS的酶活测定 | 第97-98页 |
| 4.3.6 菌体生长曲线的绘制 | 第98页 |
| 4.3.7 底物葡萄糖浓度的测定 | 第98页 |
| 4.3.8 发酵产物浓度的测定 | 第98页 |
| 4.3.9 Fe~(3+)对α-乙酰乳酸非酶氧化生成丁二酮的促进作用 | 第98页 |
| 4.3.10 统计学分析 | 第98页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第98-106页 |
| 4.4.1 alsS启动子P_(als)的验证 | 第98-99页 |
| 4.4.2 重组质粒pHY300PLK-alsS的构建及酶切验证 | 第99-100页 |
| 4.4.3 B.sp.DL01-⊿alsD-alsS的构建及验证 | 第100页 |
| 4.4.4 ALS酶活分析 | 第100-101页 |
| 4.4.5 B.sp.DL01-⊿alsD-alsS的生长曲线特征 | 第101-102页 |
| 4.4.6 B.sp.DL01-⊿alsD-alsS的葡萄糖消耗曲线特征 | 第102-103页 |
| 4.4.7 增强ALS表达对B.sp.DL01发酵生产丁二酮的影响 | 第103-105页 |
| 4.4.8 Fe~(3+)对α-乙酰乳酸非酶氧化生成丁二酮的促进作用 | 第105-106页 |
| 4.5 本章小结 | 第106-108页 |
| 5 B.sp.DL01丁二酮发酵工艺的优化 | 第108-131页 |
| 5.1 引言 | 第108页 |
| 5.2 实验材料 | 第108-109页 |
| 5.2.1 实验仪器与设备 | 第108页 |
| 5.2.2 菌株 | 第108页 |
| 5.2.3 实验试剂 | 第108页 |
| 5.2.4 培养基 | 第108-109页 |
| 5.3 实验方法 | 第109-110页 |
| 5.3.1 培养方法 | 第109页 |
| 5.3.2 菌株生长曲线的绘制 | 第109页 |
| 5.3.3 葡萄糖浓度的测定 | 第109-110页 |
| 5.3.4 发酵产物浓度的测定 | 第110页 |
| 5.3.5 发酵液中α-乙酰乳酸的检测 | 第110页 |
| 5.3.6 统计学分析 | 第110页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第110-129页 |
| 5.4.1 培养温度对丁二酮发酵的影响 | 第110-111页 |
| 5.4.2 接种量对丁二酮发酵的影响 | 第111页 |
| 5.4.3 摇床转速对丁二酮发酵的影响 | 第111-112页 |
| 5.4.4 初始pH对丁二酮发酵的影响 | 第112-113页 |
| 5.4.5 无机氮源对丁二酮发酵的影响 | 第113-114页 |
| 5.4.6 二价金属离子对丁二酮发酵的影响 | 第114-116页 |
| 5.4.7 发酵罐水平pH对丁二酮发酵的影响 | 第116-117页 |
| 5.4.8 发酵罐水平通气量对丁二酮发酵的影响 | 第117-122页 |
| 5.4.9 发酵罐水平搅拌转速对丁二酮发酵的影响 | 第122-126页 |
| 5.4.10 发酵罐水平恒底物补料对丁二酮发酵的影响 | 第126-129页 |
| 5.5 本章小结 | 第129-131页 |
| 6 结论与展望 | 第131-133页 |
| 6.1 结论 | 第131-132页 |
| 6.2 创新点 | 第132页 |
| 6.3 展望 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-144页 |
| 附录A alsD敲除基因片段测序结果(4494 bp) | 第144-146页 |
| 附录B alsD敲除基因片段部分测序图 | 第146-147页 |
| 作者简介 | 第147-148页 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
