| 致谢 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| 文献综述 | 第11-21页 |
| 1 肠球菌概述 | 第11-17页 |
| ·肠球菌的分类和生物学特性 | 第11-12页 |
| ·肠球菌的流行性 | 第12页 |
| ·肠球菌的应用 | 第12-13页 |
| ·肠球菌主要毒力因子及其致病性 | 第13-17页 |
| 2 肠球菌的生物被膜 | 第17-21页 |
| ·生物被膜的定义 | 第18页 |
| ·生物被膜的形成 | 第18页 |
| ·生物被膜形成相关因子 | 第18-21页 |
| ·肠球菌表面蛋白(Enterococcal Surface Protein) | 第18页 |
| ·菌毛(Pill) | 第18-19页 |
| ·自溶素(autolysin) | 第19页 |
| ·明胶酶(Gelatinase,GelE) | 第19页 |
| ·粪肠球菌心内膜炎抗原(Enterococcus faecalis endocarditis antigen,EfaA)11 | 第19页 |
| ·聚集物质(AS) | 第19页 |
| ·胶原蛋白黏附素(Ace) | 第19页 |
| ·胞外DNA(extracellular DNA,eDNA) | 第19-20页 |
| ·葡萄糖(glucose) | 第20-21页 |
| 引言 | 第21-22页 |
| 试验一 猪源粪肠球菌表面蛋白(Esp)的基因克隆及原核表达及纯化 | 第22-37页 |
| 1 材料 | 第22-24页 |
| ·菌株与载体 | 第22页 |
| ·主要仪器 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·主要溶液和培养基的配制 | 第23-24页 |
| 2 方法 | 第24-31页 |
| ·DNA模板的制备 | 第25页 |
| ·引物选择与合成 | 第25页 |
| ·Esp基因的扩增 | 第25-26页 |
| ·PCR的反应体系 | 第25-26页 |
| ·PCR反应程序Esp的扩增在PCR仪上进行,反应程序如下 | 第26页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第26页 |
| ·重组质粒构建与鉴定 | 第26-28页 |
| ·PCR产物与T载体的连接 | 第26页 |
| ·感受态细胞制备 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的转化 | 第27页 |
| ·小量重组质粒的筛选和提取 | 第27页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第27-28页 |
| ·检测肠球菌esp基因携带率 | 第28页 |
| ·粪肠球菌表面蛋白Esp的原核表达 | 第28-31页 |
| ·引物选择与合成 | 第28页 |
| ·Esp的扩增 | 第28-29页 |
| ·PCR反应体系 | 第28页 |
| ·PCR反应程序 | 第28页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第28页 |
| ·Esp双酶切 | 第28-29页 |
| ·空载体的制备 | 第29页 |
| ·空载体菌的纯化和扩增 | 第29页 |
| ·空载体的小量提取 | 第29页 |
| ·原核表达质粒(空载体)的双酶切 | 第29页 |
| ·重组载体的构建与鉴定 | 第29-30页 |
| ·连接反应 | 第29页 |
| ·表达菌BL_(21)(DE_3)感受态细胞制备 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的转化 | 第30页 |
| ·重组质粒的筛选和提取 | 第30页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒的诱导表达及纯化 | 第30-31页 |
| ·IPTG最佳诱导浓度的确定 | 第30页 |
| ·IPTG最佳诱导时间的确定 | 第30-31页 |
| ·大量诱导表达 | 第31页 |
| ·融合表达产物的可溶性鉴定 | 第31页 |
| ·镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化 | 第31页 |
| ·Western blot | 第31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-35页 |
| ·目的基因的扩增 | 第31-32页 |
| ·扩增目的基因的序列测序 | 第32页 |
| ·肠球菌Esp基因的携带率 | 第32页 |
| ·肠球菌表面蛋白Esp原核表达结果 | 第32-35页 |
| ·目的基因的扩增 | 第32-33页 |
| ·重组质粒诱导表达条件的优化 | 第33-34页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第34页 |
| ·Western blot | 第34-35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| 试验二 编码esp等LPTXG基序样物质的基因对生物被膜形成的影响 | 第37-45页 |
| 1 材料与方法 | 第37-40页 |
| ·试验菌株 | 第37页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第37页 |
| ·主要溶液和培养基的配制 | 第37-38页 |
| ·引物 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-40页 |
| ·刚果红培养基筛选生物被膜菌 | 第38-39页 |
| ·粪肠球菌总RNA的提取 | 第39页 |
| ·反转录合成cDNA | 第39页 |
| ·实时荧光定量PCR检测生物被膜阳性菌与生物被膜阴性菌中各基因的表达情况 | 第39-40页 |
| ·数据分析 | 第40页 |
| 2 结果 | 第40-43页 |
| ·刚果红培养基鉴定结果 | 第40页 |
| ·粪肠球菌总RNA的提取结果 | 第40-41页 |
| ·基因熔解曲线 | 第41-42页 |
| ·实时荧光定量PCR检测生物被膜阳性菌与生物被膜阴性菌中各基因的表达情况 | 第42-43页 |
| 3 讨论 | 第43-45页 |
| 试验三 猪源粪肠球菌Ace的黏附阻断及其对生物被膜形成的影响 | 第45-49页 |
| 1 材料 | 第45页 |
| ·菌株、细胞与载体 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·主要溶液及培养基的配制 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-46页 |
| ·IPEC-J2细胞的培养 | 第45页 |
| ·肠球菌的细胞黏附 | 第45-46页 |
| ·Ace对粪肠球菌生物被膜形成能力影响 | 第46页 |
| ·数据分析 | 第46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-47页 |
| ·黏附与抑制结果 | 第46-47页 |
| ·Ace对粪肠球菌生物被膜形成能力影响结果 | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 全文总结 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-58页 |
| Abstract | 第58-60页 |
| 发表论文 | 第60页 |
