| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-22页 |
| 1 禽流感病毒概述 | 第12-13页 |
| ·禽流感病毒形态结构 | 第12页 |
| ·禽流感基因组结构及其编码蛋白 | 第12-13页 |
| 2 H9亚型禽流感流行情况 | 第13-14页 |
| ·国外流行情况 | 第13-14页 |
| ·国内流行情况 | 第14页 |
| 3 禽流感疫苗的研究进展 | 第14-15页 |
| ·全病毒灭活疫苗 | 第14页 |
| ·重组活载体疫苗 | 第14-15页 |
| ·亚单位疫苗 | 第15页 |
| ·核酸疫苗 | 第15页 |
| ·反义基因工程疫苗 | 第15页 |
| ·新型流感疫苗 | 第15页 |
| 4 流感病毒受体研究 | 第15-17页 |
| ·流感病毒受体的性质 | 第15-16页 |
| ·与唾液酸受体相关的酶类 | 第16-17页 |
| ·唾液酸酶 | 第16页 |
| ·唾液酸转移酶 | 第16-17页 |
| 5 流感病毒受体分布及作用 | 第17-19页 |
| ·禽类 | 第17-18页 |
| ·水禽类 | 第17页 |
| ·陆地禽类 | 第17-18页 |
| ·哺乳动物类 | 第18页 |
| ·人类 | 第18-19页 |
| 6 影响流感病毒与细胞受体结合的因素 | 第19-22页 |
| ·唾液酸的键合类型和糖链的结构 | 第19页 |
| ·HA受体结合位点 | 第19-21页 |
| ·其他因素 | 第21-22页 |
| 引言 | 第22-23页 |
| 试验一 鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建 | 第23-35页 |
| 1 材料和方法 | 第23-31页 |
| ·材料 | 第23-25页 |
| ·载体和菌株 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| ·试剂的配制 | 第23-25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳试剂配制 | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌转化用溶液 | 第24页 |
| ·焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的配制 | 第24页 |
| ·感受态细胞制备 | 第24-25页 |
| ·方法 | 第25-31页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因的克隆 | 第25-28页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因的引物设计与合成 | 第25页 |
| ·鸡肠道组织总RNA的提取 | 第25页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第25页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因的PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第26页 |
| ·重组克隆质粒的构建 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第27-28页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因生物信息学分析 | 第28页 |
| ·pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体的构建 | 第28-31页 |
| ·引物的设计及合成 | 第28页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因的扩增 | 第28-29页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第29页 |
| ·PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收 | 第29页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第29-31页 |
| 2 结果与分析 | 第31-33页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因的RT-PCR扩增结果 | 第31页 |
| ·重组克隆质粒pGEM-ST3GAL Ⅰ的鉴定 | 第31页 |
| ·鸡ST3GAL Ⅰ基因测序结果及序列分析 | 第31-32页 |
| ·不同物种ST3Gal Ⅰ基因的同源性分析 | 第32-33页 |
| ·重组真核表达质粒pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ的鉴定 | 第33页 |
| 3 讨论 | 第33-35页 |
| 试验二 MDCK细胞转染条件的优化及pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ在MDCK细胞上的表达 | 第35-48页 |
| 1 材料与方法 | 第35-42页 |
| ·材料 | 第35页 |
| ·质粒和细胞 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35页 |
| ·所需溶液配制 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-42页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP重组质粒的构建 | 第35-38页 |
| ·引物的设计及合成 | 第35-36页 |
| ·EGFP基因的扩增 | 第36页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第36页 |
| ·PCR产物和pcDNA3.1(+)载体的酶切回收 | 第36页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第36-38页 |
| ·连接产物的转化 | 第38页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第38页 |
| ·MDCK细胞转染条件优化 | 第38-41页 |
| ·细胞准备 | 第38-39页 |
| ·无内毒素质粒制备 | 第39-40页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞 | 第40页 |
| ·质粒与脂质体比例对转染效率的影响 | 第40页 |
| ·质粒用量对转染效率的影响 | 第40页 |
| ·细胞密度对转染效率的影响 | 第40-41页 |
| ·pcDNA3.1-ST3GAL Ⅰ真核表达载体在MDCK细胞的表达 | 第41页 |
| ·RT-PCR检测ST3GALⅠ基因mRNA转录水平表达 | 第41-42页 |
| ·内参基因合成 | 第41页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·RNA中DNA的消化 | 第42页 |
| ·总RNA含量测定 | 第42页 |
| ·cDNA的合成 | 第42页 |
| ·ST3GALⅠ基因的扩增 | 第42页 |
| ·内参GAPDH基因的扩增 | 第42页 |
| 2 结果与分析 | 第42-46页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP真核表达质粒的鉴定 | 第42页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1-EGFP质粒PCR鉴定 | 第42页 |
| ·重组质粒pcDNA3.1-EGFP酶切鉴定 | 第42页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP质粒转染MDCK细胞条件优化 | 第42-44页 |
| ·质粒与脂质体比例对转染效率的影响 | 第42-44页 |
| ·质粒用量对转染效率的影响 | 第44页 |
| ·细胞密度对转染效率的影响 | 第44页 |
| ·RT-PCR检测转染MDCK细胞后ST3GAL Ⅰ基因mRNA转录水平表达 | 第44-46页 |
| ·细胞总RNA完整性及纯度检测 | 第44-45页 |
| ·RT-PCR检测ST3GAL基因mRNA转录水平表达 | 第45-46页 |
| 3 讨论 | 第46-48页 |
| 试验三 H9亚型禽流感病毒在过表达ST3GAL Ⅰ基因的MDCK细胞上的增殖情况 | 第48-53页 |
| 1 材料与方法 | 第48-49页 |
| ·材料 | 第48页 |
| ·毒株 | 第48页 |
| ·细胞与质粒 | 第48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·所需试剂配制 | 第48页 |
| ·方法 | 第48-49页 |
| ·H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖 | 第48-49页 |
| ·H9亚型禽流感病毒HA试验 | 第49页 |
| ·H9亚型禽流感病毒TCID50的测定 | 第49页 |
| 2 结果 | 第49-51页 |
| ·转染组与未转染组CPE结果 | 第49页 |
| ·HA结果 | 第49-50页 |
| ·TCID50测定结果 | 第50-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 全文总结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-61页 |
| 英文摘要 | 第61-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
