| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 縮略语表 | 第15-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-36页 |
| 1 精原干细胞内源性调节机制研究进展 | 第17-22页 |
| ·精原干细胞的起源 | 第17-18页 |
| ·精原干细胞的生物活性 | 第18-19页 |
| ·SSC龛内因子 | 第19-22页 |
| 2 SSCs表面表型的研究进展 | 第22-26页 |
| ·表面表型的初步理解 | 第22-23页 |
| ·造血干细胞和SSCs表面表型的共性 | 第23-24页 |
| ·GDNF的受体复合物作为一种特定的SSCs表型 | 第24-25页 |
| ·水牛SSCs表面表型的研究进展 | 第25-26页 |
| 3 外源生长因子对精原干细胞自我更新的影响 | 第26-31页 |
| ·GDNF影响SSCs的增殖和正常生精功能 | 第26-27页 |
| ·啮齿动物SSCs的体外长期培养体系 | 第27-28页 |
| ·GDNF与精原干细胞体外长期自我更新 | 第28-29页 |
| ·bFGF和EGF与SSCs体外自我更新 | 第29-30页 |
| ·其他体外培养添加物进展 | 第30-31页 |
| 4 生长抑素 | 第31页 |
| 5 PB转座子介导RNAi技术 | 第31-32页 |
| 6 SSCs移植介导转基因动物生产的研究进展 | 第32-34页 |
| ·SSCs的移植 | 第32-33页 |
| ·移植前转基因 | 第33-34页 |
| 7 本项目的研究目的和意义 | 第34-36页 |
| 第二章 水牛精原干细胞(SSCS)分子标志筛查与体外培养 | 第36-67页 |
| 1 引言 | 第36页 |
| 2 材料与方法 | 第36-51页 |
| ·材料 | 第36-37页 |
| ·实验动物 | 第36页 |
| ·主要仪器和材料 | 第36-37页 |
| ·主要试剂 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-51页 |
| ·试剂配制 | 第37-38页 |
| ·样品的采集 | 第38-39页 |
| ·免疫组化 | 第39-40页 |
| ·Western blot检测 | 第40-43页 |
| ·精原细胞的分离 | 第43页 |
| ·水牛精原干细胞的纯化 | 第43-44页 |
| ·流式细胞分析 | 第44-45页 |
| ·饲养层准备 | 第45-47页 |
| ·精原干细胞体外培养 | 第47页 |
| ·精原细胞克隆的增殖分析 | 第47页 |
| ·免疫细胞化学 | 第47-48页 |
| ·克隆分离和RT-PCR、qRT-PCR检测 | 第48-51页 |
| ·供体细胞移植 | 第51页 |
| ·统计分析 | 第51页 |
| 3 结果与讨论 | 第51-62页 |
| ·CDH1的转录水平表达 | 第51-52页 |
| ·水牛睾丸组织中CDH1定位 | 第52-53页 |
| ·水牛睾丸组织CDH1蛋白表达 | 第53-54页 |
| ·水牛SSCs的分离和纯化效率 | 第54页 |
| ·体外培养的胚胎成纤维细胞(MEF) | 第54-55页 |
| ·清饲养层培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数 | 第55-57页 |
| ·生长因子培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数 | 第57-59页 |
| ·体外培养SSCs克隆中特异性分子标志表达 | 第59-61页 |
| ·生长因子对SSCs克隆的分子标志mRNA水平表达的影响 | 第61页 |
| ·水牛SSCs在受体睾丸中的定植 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-67页 |
| ·CDH1在水牛精原干细胞中的表达与定位 | 第62-63页 |
| ·水牛SSCs纯化效果 | 第63页 |
| ·水牛SSCs体外培养中增殖特性 | 第63-64页 |
| ·血清与饲养层体外培养体系的优化 | 第64-65页 |
| ·生长因子对水牛精原干细胞在体外增殖的影响 | 第65-67页 |
| 第三章 转基因载体的构建与功能验证 | 第67-94页 |
| 1 引言 | 第67页 |
| 2 材料和方法 | 第67-79页 |
| ·材料 | 第67-70页 |
| ·试验动物和细胞 | 第67页 |
| ·干扰载体 | 第67-68页 |
| ·所用试剂 | 第68-69页 |
| ·主要试剂盒 | 第69-70页 |
| ·主要抗体 | 第70页 |
| ·方法 | 第70-79页 |
| ·SS基因RNA干扰载体构建 | 第70-74页 |
| ·SS干扰质粒转染BHK-21细胞 | 第74-75页 |
| ·细胞总RNA的提取及逆转录 | 第75页 |
| ·qRT-PCR检测质粒在mRNA水平的干扰效率 | 第75-76页 |
| ·生长抑素表达水平检测 | 第76-77页 |
| ·流式检测转染后细胞凋亡 | 第77页 |
| ·流式检测转染后细胞周期 | 第77-78页 |
| ·转染后凋亡和周期相关蛋白检测 | 第78-79页 |
| ·统计分析 | 第79页 |
| 3 结果与分析 | 第79-91页 |
| ·生长抑素RNAi载体构建 | 第79-83页 |
| ·设计及合成的shRNA | 第79-80页 |
| ·双链退火得到shRNA | 第80页 |
| ·ph1载体质粒验证结果 | 第80-82页 |
| ·真核表达干扰质粒的鉴定结果 | 第82-83页 |
| ·生长抑素干扰载体的转染结果 | 第83-87页 |
| ·转染效果 | 第83-84页 |
| ·所提总RNA的质量 | 第84-85页 |
| ·细胞激素水平的干扰效率 | 第85-86页 |
| ·细胞在mRNA水平的干扰效果 | 第86-87页 |
| ·转染SS干扰质粒对BHK-21细胞的影响 | 第87-91页 |
| ·转染对细胞周期的影响 | 第87-88页 |
| ·转染对细胞凋亡的影响 | 第88-90页 |
| ·转染对BHK-21细胞生长抑素受体的影响 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| ·关于干扰效果的讨论 | 第91页 |
| ·干扰SS后BHK-21细胞凋亡和周期变化 | 第91页 |
| ·干扰SS对BHK-21细胞SSTR的影响 | 第91-93页 |
| 5 小结 | 第93-94页 |
| 第四章 水牛SSCs的异种移植 | 第94-116页 |
| 1 引言 | 第94页 |
| 2 材料和方法 | 第94-102页 |
| ·材料 | 第94-95页 |
| ·主要试剂 | 第94-95页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第95页 |
| ·动物 | 第95页 |
| ·方法 | 第95-102页 |
| ·检测昆明小鼠对白消安的剂量反应 | 第95-99页 |
| ·移植 | 第99-102页 |
| ·统计分析 | 第102页 |
| 3 结果与分析 | 第102-112页 |
| ·剂量反应 | 第102-108页 |
| ·受体小鼠的体重变化 | 第102-103页 |
| ·受体小鼠睾酮水平变化 | 第103-104页 |
| ·受体小鼠睾丸组织学变化 | 第104-108页 |
| ·供体细胞准备 | 第108-109页 |
| ·水牛SSCs的体外转染效果 | 第108页 |
| ·供体细胞荧光镜检及移植 | 第108-109页 |
| ·移植后的受体睾丸分析结果 | 第109-112页 |
| ·受体睾丸中供体SSCs的增殖状况 | 第109-111页 |
| ·受体睾丸中供体细胞PCR检测结果 | 第111-112页 |
| 4 讨论 | 第112-115页 |
| ·白消安剂量优化 | 第112页 |
| ·SSCs转基因途径 | 第112-113页 |
| ·受体睾丸中供体SSCs鉴定 | 第113-114页 |
| ·受体睾丸中供体SSCs的增殖和分化 | 第114-115页 |
| 5 结论 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-133页 |
| 研究创新点 | 第133页 |
| 不足 | 第133-134页 |
| 附录Ⅰ 重组ph1质粒测序图谱 | 第134-135页 |
| 附录Ⅱ 在读期间发表的学术论著/论文 | 第135-136页 |
| 致谢 | 第136页 |