| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-24页 |
| 第一章 PED的流行及分子生物学特性 | 第13-17页 |
| 前言 | 第13页 |
| 1. PED的流行病学 | 第13-14页 |
| 2 PEDV分子生物学特性 | 第14-17页 |
| ·病原学 | 第14页 |
| ·PEDV 的分子结构 | 第14-17页 |
| ·基因组结构 | 第14-15页 |
| ·非结构基因及其产物 | 第15页 |
| ·结构基因及其产物 | 第15-17页 |
| 第二章 TGE的流行病学及分子生物学特性 | 第17-21页 |
| 1 TGE的流行 | 第17页 |
| 2 TGE分子生物学特性 | 第17-21页 |
| ·病原学 | 第17页 |
| ·TGEV分子结构 | 第17-21页 |
| ·基因组结构 | 第17-18页 |
| ·非结构蛋白 | 第18-19页 |
| ·结构蛋白 | 第19-21页 |
| 第三章 PED、TGE的诊断方法及治疗 | 第21-24页 |
| ·临床症状 | 第21页 |
| ·致病机制 | 第21页 |
| ·诊断方法 | 第21-24页 |
| ·电镜检测法 | 第21-22页 |
| ·免疫荧光技术 | 第22页 |
| ·病毒中和试验 | 第22页 |
| ·ELISA法 | 第22页 |
| ·PCR检测法 | 第22-23页 |
| ·放射性探针杂交技术 | 第23-24页 |
| 第二部分 试验部分 | 第24-65页 |
| 试验一 猪病毒性腹泻多重RT-PCR检测方法的建立 | 第24-40页 |
| 一 材料与方法 | 第24-29页 |
| ·病料的采集 | 第24页 |
| ·试验材料 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·引物合成 | 第24-25页 |
| ·病料样品的预处理 | 第25页 |
| ·RNA的提取 | 第25-26页 |
| ·粪便样品 | 第25页 |
| ·肠组织样品 | 第25-26页 |
| ·cDNA的合成 | 第26页 |
| ·目的片断的PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的电泳 | 第27页 |
| ·扩增片段的胶回收 | 第27页 |
| ·纯化目的片段的T-A克隆 | 第27-28页 |
| ·纯化目的片段与载体连接 | 第27页 |
| ·连接产物的转化 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第28页 |
| ·扩增片段的序列测定及分析 | 第28-29页 |
| ·单项PCR条件的优化 | 第29页 |
| ·最佳退火温度的确定 | 第29页 |
| ·引物浓度范围的确定 | 第29页 |
| ·反应敏感性测定 | 第29页 |
| ·PCR特异性检测 | 第29页 |
| ·多重RT-PCR检测方法的建立及条件优化 | 第29页 |
| ·多重PCR引物浓度的优化 | 第29页 |
| ·多重PCR退火温度的优化 | 第29页 |
| 二、结果 | 第29-37页 |
| ·单项PCR引物浓度及退火温度的确定 | 第29-34页 |
| ·PEDV退火温度 | 第29-30页 |
| ·PEDV引物浓度 | 第30-31页 |
| ·PEDV敏感性 | 第31页 |
| ·TGEV退火温度 | 第31-32页 |
| ·TGEV引物浓度 | 第32页 |
| ·TGEV敏感性 | 第32-33页 |
| ·引物的特异性检测 | 第33-34页 |
| ·多重PCR反应条件的优化及最终反应条件 | 第34-36页 |
| ·多重PCR退火温度的确定 | 第34-35页 |
| ·多重PCR引物浓度的确定 | 第35-36页 |
| ·PEDV及TGEV江西地区的流行病学调查 | 第36页 |
| ·多重RT-PCR产物的序列分析 | 第36-37页 |
| ·PEDV基因扩增片段的序列测定与分析 | 第36-37页 |
| ·PEDV基因扩增片段同源性分析 | 第37页 |
| 三、小结与讨论 | 第37-40页 |
| ·病料RNA的抽提及cDNA合成 | 第38页 |
| ·引物的设计 | 第38-39页 |
| ·反应组分对多重PCR的影响 | 第39-40页 |
| 试验二 IC模板的构建及其在PEDV RT-PCR中的应用 | 第40-50页 |
| 前言 | 第40页 |
| 一 材料和方法 | 第40-46页 |
| ·PEDV阳性样本的收集 | 第40页 |
| ·IC模板的构建(技术路线) | 第40-41页 |
| ·IC模板的引物设计 | 第41页 |
| ·IC片段的合成 | 第41页 |
| ·IC片段的胶回收 | 第41-42页 |
| ·IC片段的TOPO-TA克隆 | 第42页 |
| ·IC片段与pCR2.1 载体的连接 | 第42页 |
| ·IC片段的转化 | 第42页 |
| ·pCR2.1-IC重组质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组菌的扩大培养 | 第42-43页 |
| ·菌液PCR | 第43页 |
| ·质粒提取 | 第43-44页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第44页 |
| ·pCR2.1-IC重组质粒的线性化 | 第44页 |
| ·IC片段的体外转录 | 第44页 |
| ·IC片段的纯化 | 第44-45页 |
| ·IC模板的完整性检查 | 第45页 |
| ·IC模板的敏感性范围检测 | 第45页 |
| ·IC模板在PEDV RT-PCR中的应用 | 第45-46页 |
| 二、结果 | 第46-48页 |
| ·IC模板的扩增 | 第46页 |
| ·IC模板的完整性检测 | 第46-47页 |
| ·IC模板的敏感性范围检测 | 第47页 |
| ·IC模板在RT-PCR中的应用 | 第47-48页 |
| 三、小结与讨论 | 第48-50页 |
| 试验三 猪流行性腹泻病毒S1全基因测定及序列分析 | 第50-65页 |
| 一、材料与方法 | 第50-54页 |
| ·病料来源 | 第50页 |
| ·试验材料 | 第50页 |
| ·主要仪器设备 | 第50-51页 |
| ·引物合成 | 第51页 |
| ·病料的预处理 | 第51页 |
| ·RNA的提取 | 第51-52页 |
| ·cDNA的合成 | 第52页 |
| ·S1 基因的PCR扩增 | 第52-53页 |
| ·PCR产物的电泳 | 第53页 |
| ·目的片段的胶回收 | 第53页 |
| ·纯化目的片段的T-A克隆 | 第53-54页 |
| ·纯化目的片段与T载体连接 | 第53页 |
| ·连接产物的转化 | 第53-54页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第54页 |
| ·S1 基因序列测定、分析和比较 | 第54页 |
| 二、结果 | 第54-63页 |
| ·S1 基因在全基因序列中的位置 | 第54-55页 |
| ·S1 基因的RT-PCR扩增 | 第55-56页 |
| ·S1 基因测序结果及分析 | 第56-63页 |
| ·PEDV S1 基因测序结果的处理 | 第56页 |
| ·S1 基因序列分析 | 第56-57页 |
| ·PEDV流行毒株系统演化关系 | 第57-61页 |
| ·S1 基因蛋白分析 | 第61-62页 |
| ·PEDV S1 蛋白抗原表位域、抗原表位分析 | 第62-63页 |
| 三、小结与讨论 | 第63-65页 |
| 全文总结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 致谢 | 第70页 |