| 中文摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-52页 |
| 引言 | 第19页 |
| 1.几丁质酶的研究进展 | 第19-33页 |
| ·几丁质酶的分类与命名 | 第20-21页 |
| ·真菌几丁质酶的分离和纯化 | 第21-22页 |
| ·几丁质酶产生菌的筛选 | 第21页 |
| ·真菌几丁质酶的纯化 | 第21-22页 |
| ·真菌几丁质酶的克隆与表达 | 第22-27页 |
| ·真菌几丁质酶的基因克隆 | 第22-25页 |
| ·真菌几丁质酶基因的表达 | 第25-27页 |
| ·几丁质酶的结构与功能 | 第27-30页 |
| ·信号肽序列 | 第28页 |
| ·催化域 | 第28-29页 |
| ·结合域 | 第29-30页 |
| ·富含Ser/Thr区和C端序列 | 第30页 |
| ·真菌几丁质酶基因的表达调控 | 第30-31页 |
| ·真菌几丁质酶的性质 | 第31页 |
| ·真菌几丁质酶的应用 | 第31-33页 |
| ·在生物资源开发中的应用 | 第32页 |
| ·在生物防治中的应用 | 第32-33页 |
| 2.热稳定几丁质酶的研究 | 第33-35页 |
| 3.酶的分子改造 | 第35-44页 |
| ·酶的分子改造的方法 | 第35-42页 |
| ·结构域改组 | 第35-36页 |
| ·定点突变 | 第36-39页 |
| ·遗传密码偏爱设计 | 第39-40页 |
| ·易错PCR(error-prone PCR)方法 | 第40页 |
| ·改组技术 | 第40-42页 |
| ·分子改造在酶蛋白中的应用 | 第42-43页 |
| ·几丁质酶的分子改造 | 第43-44页 |
| 4. 糖苷合成酶的研究进展 | 第44-50页 |
| ·糖苷合成酶产生的背景 | 第44-45页 |
| ·糖苷合成酶及其作用机制 | 第45-47页 |
| ·糖苷合成酶的研究概况 | 第47-50页 |
| 5. 选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第50-52页 |
| ·选题的目的意义 | 第50页 |
| ·研究内容 | 第50-51页 |
| ·技术路线 | 第51-52页 |
| 第二章 嗜热子囊菌原变种热稳定几丁质酶基因的克隆、表达及性质研究 | 第52-103页 |
| 1.材料与方法 | 第53-73页 |
| ·材料 | 第53-55页 |
| ·供试菌株 | 第53页 |
| ·主要试剂和生物酶 | 第53页 |
| ·菌株和质粒 | 第53页 |
| ·仪器 | 第53页 |
| ·溶液配制 | 第53-54页 |
| ·培养基 | 第54-55页 |
| ·嗜热子囊菌原变种热稳定几丁质酶cDNA基因的克隆 | 第55-63页 |
| ·引物设计 | 第55页 |
| ·总RNA的提取(Trizol法) | 第55-56页 |
| ·反转录cDNA第一链的合成 | 第56-57页 |
| ·目的基因cDNA中间片段的分离 | 第57-59页 |
| ·目的基因3'末端的分离(3'-RACE) | 第59-60页 |
| ·目的基因DNA序列和全长cDNA的克隆 | 第60-63页 |
| ·嗜热子囊菌原变种热稳定几丁质酶cDNA基因的表达 | 第63-71页 |
| ·几丁质酶基因序列的分离 | 第63-64页 |
| ·质粒的提取 | 第64-65页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第65-66页 |
| ·线性化质粒的制备 | 第66页 |
| ·毕赤酵母电击转化 | 第66-67页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第67-70页 |
| ·酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达 | 第70页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第70-71页 |
| ·表达几丁质酶的SDS-PAGE分析 | 第71页 |
| ·表达几丁质酶工程菌产酶曲线的测定 | 第71页 |
| ·酵母工程菌株分泌表达产物的纯化 | 第71-72页 |
| ·发酵液的硫酸铵沉淀 | 第71页 |
| ·DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析 | 第71页 |
| ·蛋白质分子量测定和纯度鉴定 | 第71-72页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第72页 |
| ·表达的几丁质酶酶学性质的研究 | 第72-73页 |
| ·最适反应温度和最适反应pH的测定 | 第72页 |
| ·表达几丁质酶的热稳定性和pH稳定性的测定 | 第72页 |
| ·表达几丁质酶的底物特异性 | 第72-73页 |
| ·降解产物的分析 | 第73页 |
| ·抗菌活性的分析 | 第73页 |
| 2.结果与分析 | 第73-98页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁酶基因扩增的克隆 | 第73-78页 |
| ·嗜热子囊菌原变种总RNA的提取 | 第73-74页 |
| ·嗜热子囊菌原变种基因组DNA的提取 | 第74页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因中间片段的分离 | 第74-75页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因3'-末端cDNA的分离 | 第75-76页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因cDNA 5'-末端的分离 | 第76页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因全长cDNA的克隆 | 第76-77页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶全长DNA的扩增 | 第77-78页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第78-85页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因的cDNA和DNA序列分析 | 第79-80页 |
| ·几丁质酶基因Chit-TAA的氨基酸序列分析 | 第80-81页 |
| ·几丁质酶基因Chit-TAA蛋白质的结构功能区分析 | 第81-82页 |
| ·几丁质酶基因Chit-TAA的一级结构分析 | 第82-83页 |
| ·几丁质酶Chit-TAA二级结构分析 | 第83页 |
| ·几丁质酶的三级结构分析 | 第83-84页 |
| ·几丁质酶基因Chit-TAA的同源性分析 | 第84-85页 |
| ·几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第85-92页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质基因编码区的分离 | 第85页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第85-88页 |
| ·重组酵母转化子的筛选 | 第88-91页 |
| ·Chit-TAA在P.pastoris中的高效表达及表达产物的检测 | 第91-92页 |
| ·重组几丁质酶Chit-TAA蛋白的纯化鉴定及分子量的测定 | 第92-93页 |
| ·表达几丁质酶Chit-TAA的性质研究 | 第93-97页 |
| ·表达几丁质酶Chit-TAA的最适反应温度 | 第93-94页 |
| ·表达几丁质酶的最适反应pH值 | 第94页 |
| ·表达几丁质酶Chit-TAA的热稳定 | 第94-95页 |
| ·表达几丁质酶Chit-TAA的pH稳定性 | 第95页 |
| ·金属离子对嗜热子囊菌原变种几丁质酶 | 第95-96页 |
| ·几丁质酶Chit-TAA的底物特异性 | 第96页 |
| ·几丁质酶Chit-TAA降解胶体几丁质的产物分析 | 第96-97页 |
| ·几丁质酶Chit-TAA的抗菌活性 | 第97-98页 |
| 3. 几丁质酶Tachit和CtCHIT1的底物特异性和降解产物分析 | 第98-99页 |
| 4. 讨论 | 第99-103页 |
| ·几丁质酶基因的结构 | 第99-100页 |
| ·热稳定酶在中温菌毕赤酵母中的表达 | 第100-101页 |
| ·影响毕赤酵母高效表达的原因 | 第101页 |
| ·表达几丁质酶的稳定性 | 第101-103页 |
| 第三章 嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)几丁质酶Tachit的分子改造 | 第103-145页 |
| 第一节 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶Tachit和嗜热毛壳菌纤维素酶chh1、cbh2结合域的融合 | 第103-125页 |
| 1. 材料和方法 | 第103-109页 |
| ·材料 | 第103-104页 |
| ·供试菌株 | 第103页 |
| ·供试质粒 | 第103-104页 |
| ·仪器 | 第104页 |
| ·主要生化试剂和培养基 | 第104页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的构建 | 第104-107页 |
| ·融合PCR引物设计 | 第104-105页 |
| ·待融合片段的PCR扩增 | 第105-106页 |
| ·融合PCR反应 | 第106页 |
| ·融合片段的全长扩增 | 第106-107页 |
| ·融合产物加尾 | 第107页 |
| ·融合片段Tachit-CBD1和CBD2-Tachit全长PCR产物回收 | 第107页 |
| ·融合片段Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的序列测定 | 第107页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit在毕赤酵母中的高效表达 | 第107-108页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit-酵母表达载体的构建 | 第107页 |
| ·pPIC9K/Tachit-CBD1和pPIC9K/CBD2-Tachit的线性化 | 第107-108页 |
| ·产物纯化 | 第108页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的酵母转化及酶活性研究 | 第108-109页 |
| 2. 结果与分析 | 第109-123页 |
| ·几丁质酶Tachit、纤维素酶cbh1和cbh2结构预测 | 第109页 |
| ·融合基因片段的获得 | 第109-115页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1的独立片段的PCR扩增 | 第110-111页 |
| ·融合基因CBD2-Tachit的独立片段的PCR扩增 | 第111页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit全长的PCR扩增 | 第111-112页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit氨基酸序列分析 | 第112-115页 |
| ·融合基因Tachit-CBD1和CBD2-Tachit在毕赤酵母中的表达 | 第115-119页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第115-116页 |
| ·重组质粒转化GS115及酵母转化子筛选 | 第116页 |
| ·融合酶在P.pastoris中的高效表达及表达产物的检测 | 第116-119页 |
| ·融合酶蛋白Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的纯化 | 第119页 |
| ·融合酶蛋白Tachit-CBD1和CBD2-Tachit性质研究 | 第119-123页 |
| ·表达融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的最适反应温度 | 第119-120页 |
| ·表达融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的热稳定的研究 | 第120-121页 |
| ·表达融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的最适反应pH值测定 | 第121页 |
| ·表达融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的pH稳定性测定 | 第121-122页 |
| ·表达融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit的底物特异性 | 第122页 |
| ·融合酶Tachit-CBD1和CBD2-Tachit对胶体几丁质降解产物分析 | 第122-123页 |
| 3.讨论 | 第123-125页 |
| 第二节 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶活性位点非保守氨基酸的定点突变 | 第125-138页 |
| 1.材料与方法 | 第125-129页 |
| ·材料 | 第125页 |
| ·供试质粒 | 第125页 |
| ·菌株与质粒 | 第125页 |
| ·主要试剂和生物酶 | 第125页 |
| ·仪器 | 第125页 |
| ·培养基和溶液 | 第125页 |
| ·突变体的构建 | 第125-129页 |
| ·突变位点的选择 | 第126页 |
| ·突变引物的设计 | 第126页 |
| ·定点突变PCR反应 | 第126-127页 |
| ·PCR产物的消化 | 第127-128页 |
| ·突变质粒的转化 | 第128页 |
| ·突变质粒的鉴定 | 第128-129页 |
| ·突变基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第129页 |
| ·表达产物的纯化和表达蛋白的酶学特性研究 | 第129页 |
| 2.结果与分析 | 第129-136页 |
| ·突变载体的构建 | 第129-131页 |
| ·突变基因的获得 | 第129-130页 |
| ·突变体L129F和V134I序列分析 | 第130-131页 |
| ·突变几丁质酶在毕赤酵母中的表达 | 第131-132页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第131页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9k/L129F和pPIC9K/V134转化p.pastoris GS115及酵母转 化子的筛选 | 第131-132页 |
| ·突变基因L129F和V134I在毕赤酵母中的表达 | 第132-134页 |
| ·突变基因Tachit-L129F和Tachit-V134I表达蛋白的纯化 | 第134页 |
| ·突变几丁质酶的特性研究 | 第134-136页 |
| ·突变几丁质酶的最适反应温度 | 第134-135页 |
| ·突变几丁质酶的热稳定的研究 | 第135-136页 |
| ·突变几丁质酶的最适pH值 | 第136页 |
| 3.讨论 | 第136-138页 |
| 第三节 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶必需氨基酸的突变和糖苷合成酶的初步研究 | 第138-145页 |
| 1.材料与方法 | 第138-140页 |
| ·材料 | 第138-139页 |
| ·供试质粒 | 第138页 |
| ·菌株与质粒 | 第138页 |
| ·主要试剂和生物酶 | 第138-139页 |
| ·仪器 | 第139页 |
| ·突变体的构建 | 第139-140页 |
| ·突变位点的选取和突变氨基酸的确定 | 第139页 |
| ·突变引物的设计 | 第139-140页 |
| ·定点突变PCR反应和产物的消化 | 第140页 |
| ·突变质粒的转化及鉴定 | 第140页 |
| ·突变基因在毕赤酵母中的高效表达,纯化和表达蛋白的水解活性 | 第140页 |
| ·突变体水解酶的活性测定 | 第140页 |
| ·突变体合成酶的活性测定 | 第140页 |
| 2.结果与分析 | 第140-143页 |
| ·突变体的构建 | 第140-142页 |
| ·突变基因的获得 | 第140-141页 |
| ·突变体D133G、D135G和E137G序列分析 | 第141-142页 |
| ·突变几丁质酶在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化 | 第142页 |
| ·突变酶水解活性的测定 | 第142-143页 |
| ·突变体糖苷合成酶的活性测定 | 第143页 |
| 3.讨论 | 第143-145页 |
| 第四章 全文结论与建议 | 第145-147页 |
| 1.结论 | 第145-146页 |
| ·嗜热子囊菌原变种几丁质酶基因Chit-TAA的克隆及在毕赤酵母中的表达 | 第145页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因Tachit的分子改造 | 第145页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因Tachit的定点突变 | 第145-146页 |
| ·几丁质Tachit必需氨基酸突变和糖苷合成酶的初步研究 | 第146页 |
| 2.建议 | 第146-147页 |
| 参考文献 | 第147-168页 |
| 致谢 | 第168-169页 |
| 攻读学位期间发表论文的情况 | 第169页 |
