| 目录 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-49页 |
| ·人防御素 | 第13-26页 |
| ·引言 | 第13页 |
| ·人防御素的组织分布 | 第13-14页 |
| ·人防御素的分子生物学特征 | 第14-19页 |
| ·人防御素的抗菌机理 | 第19-23页 |
| ·人防御素的医学价值和前景展望 | 第23-25页 |
| ·基因工程生产人防御素的研究进展 | 第25-26页 |
| ·肠激酶 | 第26-30页 |
| ·引言 | 第26-27页 |
| ·肠激酶的结构特点 | 第27-28页 |
| ·肠激酶的识别序列 | 第28页 |
| ·肠激酶的理化和生理特点 | 第28-29页 |
| ·基因工程菌生产肠激酶 | 第29-30页 |
| ·真核生物基因在大肠杆菌中的表达 | 第30-34页 |
| ·密码子优化 | 第31页 |
| ·融合表达体系 | 第31-34页 |
| ·包涵体蛋白质的体外折叠复性 | 第34-39页 |
| ·包涵体的制备 | 第34页 |
| ·包涵体的变性溶解 | 第34-35页 |
| ·蛋白质的体外复性方法 | 第35-39页 |
| ·本课题研究思路及拟研究的内容 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-49页 |
| 第二章 材料与方法 | 第49-53页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·质粒 | 第49页 |
| ·菌种 | 第49页 |
| ·抗体 | 第49页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49-50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| ·实验及分析方法 | 第50-52页 |
| ·分子克隆相关实验 | 第50页 |
| ·大肠杆菌菌体浓度测定 | 第50页 |
| ·大肠杆菌细胞破碎及胞内蛋白提取 | 第50-51页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第51页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第51页 |
| ·Western Blotting 分析 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-53页 |
| 第三章 人β-防御素-3及4基因的合成和表达载体的构建 | 第53-65页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·实验材料 | 第53-55页 |
| ·质粒和菌株 | 第53-54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·酶和试剂盒 | 第54-55页 |
| ·引物 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55-58页 |
| ·密码子优化 | 第55页 |
| ·全基因合成(PCR-based gene SOEing synthesis | 第55-56页 |
| ·琼脂糖凝胶回收纯化 DNA | 第56-57页 |
| ·克隆载体的构建 | 第57-58页 |
| ·质粒的提取和转化 | 第58页 |
| ·表达载体和表达菌株的构建 | 第58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-62页 |
| ·密码子优化 | 第58-60页 |
| ·全基因合成 | 第60-61页 |
| ·克隆载体构建 | 第61页 |
| ·表达载体构建 | 第61-62页 |
| ·小结 | 第62页 |
| 参考文献 | 第62-65页 |
| 第四章 重组人β-防御素-3及4的表达优化 | 第65-79页 |
| ·引言 | 第65页 |
| ·实验材料 | 第65页 |
| ·菌种 | 第65页 |
| ·培养基 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-66页 |
| ·人β-防御素-3及4的表达和western blotting分析 | 第65-66页 |
| ·表达条件的优化 | 第66页 |
| ·表达产物定量分析 | 第66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-76页 |
| ·HBD3融合蛋白的表达 | 第66-67页 |
| ·HBD3重组菌培养条件优化 | 第67-72页 |
| ·HBD4融合蛋白的表达 | 第72页 |
| ·HBD4重组菌培养条件优化 | 第72-76页 |
| ·小结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第五章 牛肠激酶轻链基因的合成及在大肠杆菌中的表达 | 第79-99页 |
| ·引言 | 第79-80页 |
| ·实验材料 | 第80-82页 |
| ·质粒和菌株 | 第80-81页 |
| ·培养基 | 第81-82页 |
| ·酶和试剂盒 | 第82页 |
| ·引物 | 第82页 |
| ·分离设备 | 第82页 |
| ·实验方法 | 第82-86页 |
| ·密码子优化 | 第82页 |
| ·全基因合成(PCR-based gene SOEing synthesis) | 第82-83页 |
| ·琼脂糖凝胶回收纯化 DNA | 第83-84页 |
| ·克隆载体的构建 | 第84页 |
| ·质粒的提取和转化 | 第84页 |
| ·表达载体和表达菌株的构建 | 第84页 |
| ·菌体培养及蛋白表达 | 第84页 |
| ·亲和层析 | 第84-86页 |
| ·结果与讨论 | 第86-97页 |
| ·密码子优化 | 第87-88页 |
| ·全基因合成 | 第88-89页 |
| ·克隆载体构建 | 第89页 |
| ·表达载体构建 | 第89-95页 |
| ·目标蛋白的表达 | 第95-96页 |
| ·亲和层析分离融合蛋白 | 第96-97页 |
| ·小结 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-99页 |
| 第六章 牛肠激酶轻链的纯化和活性测定 | 第99-109页 |
| ·引言 | 第99页 |
| ·实验材料 | 第99-100页 |
| ·菌种 | 第99页 |
| ·培养基 | 第99-100页 |
| ·分离设备 | 第100页 |
| ·透析袋 | 第100页 |
| ·实验方法 | 第100-101页 |
| ·渗透冲击法提取蛋白 | 第100页 |
| ·表达条件的优化 | 第100页 |
| ·亲和层析 | 第100-101页 |
| ·透析 | 第101页 |
| ·目标蛋白活性分析 | 第101页 |
| ·结果与讨论 | 第101-108页 |
| ·渗透冲击提取目标蛋白 | 第101-102页 |
| ·渗透冲击所得蛋白的活性鉴定 | 第102-103页 |
| ·表达条件的优化 | 第103-106页 |
| ·从渗透冲击液中提纯肠激酶 | 第106-107页 |
| ·sBEKLC1SX的活性检测 | 第107-108页 |
| ·小结 | 第108-109页 |
| 第七章牛肠激酶轻链的金属亲和层析复性 | 第109-117页 |
| ·引言 | 第109页 |
| ·实验材料 | 第109-110页 |
| ·菌种 | 第109页 |
| ·培养基 | 第109-110页 |
| ·分离设备 | 第110页 |
| ·实验方法 | 第110-111页 |
| ·菌体培养及蛋白表达 | 第110页 |
| ·融合蛋白包涵体的制备 | 第110页 |
| ·融合蛋白包涵体的变性溶解 | 第110页 |
| ·融合蛋白包涵体的亲和复性 | 第110-111页 |
| ·亲和复性条件的优化 | 第111页 |
| ·Sephadex G-10脱盐 | 第111页 |
| ·复性产物活性分析 | 第111页 |
| ·结果与讨论 | 第111-116页 |
| ·融合蛋白包涵体的制备 | 第111-112页 |
| ·目标蛋白的亲和复性与纯化 | 第112-113页 |
| ·目标蛋白亲和复性的条件优化 | 第113-115页 |
| ·复性产物的活性检测 | 第115-116页 |
| ·小结 | 第116页 |
| 参考文献 | 第116-117页 |
| 第八章 重组人β-防御素-3及4的分离纯化 | 第117-127页 |
| ·引言 | 第117页 |
| ·实验材料 | 第117-118页 |
| ·蛋白酶 | 第117页 |
| ·分离设备 | 第117-118页 |
| ·实验方法 | 第118-119页 |
| ·亲和层析纯化 HBD3、HBD4融合蛋白 | 第118页 |
| ·阳离子交换层析纯化 HBD3融合蛋白 | 第118页 |
| ·Sephadex G-10更换酶切缓冲液 | 第118页 |
| ·肠激酶酶切融合蛋白 | 第118页 |
| ·阳离子交换层析纯化 HBD3及 HBD4 | 第118页 |
| ·Sephadex G-10脱盐 | 第118-119页 |
| ·冷冻干燥 | 第119页 |
| ·结果与讨论 | 第119-124页 |
| ·亲和层析纯化融合蛋白 | 第119-120页 |
| ·阳离子交换层析纯化 HBD3融合蛋白 | 第120-121页 |
| ·肠激酶酶切融合蛋白 | 第121页 |
| ·阳离子交换层析分离重组 HBD3及 HBD4 | 第121-123页 |
| ·HBD3及 HBD4的精制 | 第123页 |
| ·分离工艺总结 | 第123-124页 |
| ·小结 | 第124-127页 |
| 第九章 重组人β防御素-3及4的活性测定 | 第127-133页 |
| ·引言 | 第127页 |
| ·实验材料 | 第127-128页 |
| ·菌种 | 第127页 |
| ·牛津杯 | 第127页 |
| ·培养基 | 第127-128页 |
| ·实验方法 | 第128-129页 |
| ·测试菌的培养 | 第128页 |
| ·液体培养法测定抑菌活性 | 第128页 |
| ·固体平板扩散法测定抑菌活性 | 第128-129页 |
| ·结果与讨论 | 第129-131页 |
| ·液体培养法测定抑菌活性 | 第129-130页 |
| ·固体平板扩散法 | 第130-131页 |
| ·小结 | 第131-133页 |
| 第十章 结论与建议 | 第133-137页 |
| ·结论 | 第133-135页 |
| ·建议 | 第135-137页 |
| 致谢 | 第137-139页 |
| 论文发表情况 | 第139页 |
