| 第一章 前言 | 第1-16页 |
| ·乳酸细菌 | 第12页 |
| ·根霉 | 第12-13页 |
| ·基因工程菌 | 第13-14页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第14-16页 |
| 第二章 L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)在大肠杆菌中的表达 | 第16-36页 |
| ·实验材料 | 第16-17页 |
| ·菌株与质粒 | 第16页 |
| ·酶与试剂 | 第16-17页 |
| ·主要仪器设备 | 第17页 |
| ·方法与步骤 | 第17-26页 |
| ·Streptococcus bovis的复苏培养 | 第18页 |
| ·菌种的保存 | 第18页 |
| ·Streptococcus bovis基因组总DNA的制备 | 第18页 |
| ·L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的克隆和表达载体的构建 | 第18-20页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第20-21页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第21页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第21-22页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第22页 |
| ·连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞 | 第22页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第22-23页 |
| ·重组子的质粒PCR验证 | 第23页 |
| ·外源片段在大肠杆菌中的诱导表达 | 第23页 |
| ·表达产物的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第23-24页 |
| ·L-(+)-乳酸脱氧酶(LDH)活性的测定 | 第24-25页 |
| ·重组L-(+)-乳酸脱氢酶(LDH)性质的研究 | 第25页 |
| ·重组质粒pSE-ldhL稳定性的研究 | 第25-26页 |
| ·结果和分析 | 第26-32页 |
| ·L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)表达质粒的构建 | 第26-27页 |
| ·L-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的不完全序列分析 | 第27-28页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第28-29页 |
| ·重组LDH活力测定分析 | 第29-30页 |
| ·重组LDH性质的分析 | 第30-32页 |
| ·重组质粒pSE-lhdL稳定性的分析 | 第32页 |
| ·讨论 | 第32-36页 |
| ·质粒的稳定性 | 第32-33页 |
| ·外源基因在大肠杆菌中的表达 | 第33-36页 |
| 第三章 大肠杆菌中D-(-)-乳酸脱氢酶基因(ldhA)敲除的研究 | 第36-50页 |
| ·实验材料 | 第38页 |
| ·菌株与质粒 | 第38页 |
| ·酶与试剂 | 第38页 |
| ·主要仪器设备 | 第38页 |
| ·方法与步骤 | 第38-43页 |
| ·Escherichia coli基因组总DNA的制备 | 第38-39页 |
| ·电穿孔大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·D-(-)-乳酸脱氢酶基因(ldhA)的引物设计和PCR扩增 | 第39-40页 |
| ·四环素抗性基因(tet~r)的引物设计和PCR扩增 | 第40-41页 |
| ·DNA的酶切与连接 | 第41页 |
| ·质粒DNA的转化 | 第41页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第41页 |
| ·重组质粒PCR验证 | 第41-42页 |
| ·ldhA基因的置换DNA片段的制备 | 第42页 |
| ·电转化大肠杆菌JM109感受态细胞 | 第42页 |
| ·基因敲除菌株的初筛及PCR验证 | 第42-43页 |
| ·结果和分析 | 第43-47页 |
| ·ldhA基因的克隆 | 第43页 |
| ·tet~r基因的克隆 | 第43-44页 |
| ·置换型同源重组质粒pSE-ldhA-tet~r的构建 | 第44-47页 |
| ·讨论 | 第47-50页 |
| 第四章 结论与展望 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 附录 | 第56-60页 |
| 致谢 | 第60-62页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第62页 |
