| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 一、前言 | 第10-22页 |
| 1 除草剂 | 第10-12页 |
| ·草甘膦简介 | 第10-12页 |
| 2 EPSP合成酶 | 第12-18页 |
| ·EPSP合成酶的发现与研究进展 | 第12-13页 |
| ·EPSP合成酶分类 | 第13页 |
| ·EPSP合成酶的定位 | 第13-14页 |
| ·EPSP合成酶的结构 | 第14-16页 |
| ·提高EPSP合成酶草甘膦抗性的途径 | 第16-18页 |
| 3 蛋白质体外改造及其技术 | 第18-22页 |
| ·理性化设计(定点突变) | 第18页 |
| ·非理性化设计(定向进化) | 第18-22页 |
| 二、重组PCR介导EPSPs基因点突变 | 第22-34页 |
| 1 材料与试剂 | 第22页 |
| ·菌株 | 第22页 |
| ·酶与试剂盒 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| 2 试验方法 | 第22-26页 |
| ·重组PCR原理 | 第22-23页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·目的片段的获得 | 第23-25页 |
| ·将目的片段克隆到pMD18-T载体上 | 第25页 |
| ·连接载体的转化 | 第25页 |
| ·目的基因的鉴定及测序 | 第25-26页 |
| 3 结果与分析 | 第26-31页 |
| ·重组PCR | 第26-27页 |
| ·菌落PCR和酶切检测 | 第27-28页 |
| ·pMD18-T-EPSPsA~*的测序鉴定 | 第28页 |
| ·蛋白质结构的对比分析 | 第28-31页 |
| 4 讨论 | 第31-34页 |
| ·突变位点的确定 | 第31-32页 |
| ·关于重组PCR技术 | 第32-34页 |
| 三、EPSPsA~*基因在大肠杆菌中的表达与分析 | 第34-52页 |
| 1 材料与试剂 | 第34页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第34页 |
| ·试剂 | 第34页 |
| 2 试验方法 | 第34-41页 |
| ·pMAL-p2X-EPSPsA~*的构建与鉴定 | 第34-38页 |
| ·pET32a-EPSPsA~*的构建与鉴定 | 第38-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-48页 |
| ·pMAL-p2X-EPSPsA~*的构建与鉴定 | 第41-45页 |
| ·pET32a-EPSPsA~*的构建与鉴定 | 第45-48页 |
| 4 讨论 | 第48-52页 |
| ·表达载体pMAL-p2X | 第48-49页 |
| ·表达载体pET32a | 第49-50页 |
| ·包涵体 | 第50-52页 |
| 四、EPSPsA~*基因植物载体的构建及对烟草的转化 | 第52-64页 |
| 1 材料与试剂 | 第52-53页 |
| ·菌株与质粒 | 第52页 |
| ·植物材料及培养基 | 第52-53页 |
| ·酶与试剂盒 | 第53页 |
| ·试剂 | 第53页 |
| 2 试验方法 | 第53-57页 |
| ·引物设计及目的基因的PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·表达载体pWM101-EPSPsA~*和pWM101-EPSPsA的构建及检测 | 第54-55页 |
| ·表达载体pWM101-EPSPsA~*和pWM101-EPSPsA转化根癌农杆菌 | 第55-56页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第56-57页 |
| ·转基因烟草的草甘膦抗性检测 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-62页 |
| ·载体pWM101-EPSPsA~*和pWM101-EPSPsA的构建流程 | 第57-58页 |
| ·目的基因PCR扩增结果 | 第58页 |
| ·菌落PCR和酶切检测 | 第58-59页 |
| ·表达载体转化农杆菌LBA4404的检测 | 第59-60页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第60-61页 |
| ·烟草愈伤对草甘膦抗性的检测结果 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-64页 |
| ·用于转化的农杆菌的培养 | 第62页 |
| ·农杆菌与叶盘共培养 | 第62页 |
| ·诱导愈伤 | 第62-63页 |
| ·草甘膦抗性检测 | 第63-64页 |
| 五、结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 附录 A 缩略词表 | 第70-71页 |
| 附录 B 主要试剂配置 | 第71-75页 |
| 附录 C 载体图谱 | 第75-77页 |
| 附录 D EPSPsA~*突变测序报告 | 第77-79页 |
| 附录 E pMAL-p2x-EPSPsA~*测序报告 | 第79-81页 |
| 附录 F pET32a-EPSPsA~*测序报告 | 第81-83页 |
| 附录 G pWM101-EPSPsA～*测序报告 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 作者简历 | 第86页 |
