| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 主要符号对照表 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-36页 |
| 1.1 Myostatin概述 | 第20-21页 |
| 1.1.1 Myostatin的发现 | 第20页 |
| 1.1.2 MSTN的结构和功能蛋白的形成 | 第20-21页 |
| 1.2 Myostatin的信号通路 | 第21-24页 |
| 1.2.1 MSTN的细胞内应答 | 第21-23页 |
| 1.2.2 MSTN细胞外调节 | 第23-24页 |
| 1.3 Myostatin的调控 | 第24-27页 |
| 1.3.1 MSTN转录水平的调控 | 第24-25页 |
| 1.3.2 MSTN转录后的调控 | 第25-26页 |
| 1.3.3 microRNA调节MSTN的表达 | 第26页 |
| 1.3.4 表观遗传学调节MSTN | 第26-27页 |
| 1.4 Myostatin的功能 | 第27-30页 |
| 1.4.1 MSTN在骨骼肌生长发育中的作用 | 第27-28页 |
| 1.4.2 MSTN对脂肪的调控作用 | 第28-29页 |
| 1.4.3 MSTN对糖代谢的调控作用 | 第29-30页 |
| 1.5 Myostain的应用 | 第30-33页 |
| 1.5.1 医学方面 | 第30-32页 |
| 1.5.2 畜牧业中的应用 | 第32-33页 |
| 1.6 生物信息学在MSTN功能研究中的应用 | 第33-36页 |
| 1.6.1 蛋白质组学在MSTN研究中的应用 | 第33-34页 |
| 1.6.2 转录组学在MSTN研究中的应用 | 第34-36页 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9 技术制备MSTN基因编辑的C2C12 细胞株 | 第36-58页 |
| 2.1 引言 | 第36页 |
| 2.2 实验材料 | 第36-40页 |
| 2.2.1 细胞株及载体 | 第36-37页 |
| 2.2.2 主要试剂与药品 | 第37-38页 |
| 2.2.3 主要仪器及耗材 | 第38页 |
| 2.2.4 主要溶液配制 | 第38-40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-52页 |
| 2.3.1 MSTN基因sgRNA的设计 | 第40页 |
| 2.3.2 CRISPR/Cas9 真核表达载体构建 | 第40-43页 |
| 2.3.3 细胞培养 | 第43-44页 |
| 2.3.4 基因组DNA抽提 | 第44-46页 |
| 2.3.5 T7EI突变检测 | 第46-48页 |
| 2.3.6 脱靶效应的检测 | 第48页 |
| 2.3.7 突变类型鉴定 | 第48页 |
| 2.3.8 Cell Counting Kit-8(CCK8)检测 | 第48页 |
| 2.3.9 细胞RNA提取和qRT-PCR | 第48-50页 |
| 2.3.10 Western Blot免疫印迹 | 第50-52页 |
| 2.3.11 统计学分析 | 第52页 |
| 2.4 试验结果 | 第52-56页 |
| 2.4.1 C2C12 成肌细胞鉴定 | 第52页 |
| 2.4.2 MSTN基因sgRNA的筛选 | 第52-55页 |
| 2.4.3 MSTN KO促进C2C12 细胞增殖 | 第55页 |
| 2.4.4 qPCR和 Western Blot鉴定MSTN基因的敲除效果 | 第55-56页 |
| 2.5 讨论和结论 | 第56-58页 |
| 第三章 基于Label-Free LC-MS/MS技术的MSTN基因敲除C2C12 细胞的蛋白质组学分析 | 第58-68页 |
| 3.1 前言 | 第58页 |
| 3.2 材料与方法 | 第58-59页 |
| 3.3 实验方法 | 第59页 |
| 3.4 实验结果 | 第59-65页 |
| 3.4.1 MSTN基因敲除C2C12 细胞的定量蛋白质组学分析结果 | 第59-61页 |
| 3.4.2 差异蛋白的生物信息学分析 | 第61-65页 |
| 3.4.3 Western Blot验证 | 第65页 |
| 3.5 讨论和结论 | 第65-68页 |
| 第四章 基于RNA-Seq技术的MSTN基因敲除的陕北白绒山羊的转录组学研究 | 第68-85页 |
| 4.1 前言 | 第68页 |
| 4.2 材料方法 | 第68页 |
| 4.3 实验试剂 | 第68-69页 |
| 4.4 实验方法 | 第69-70页 |
| 4.4.1 动物伦理声明 | 第69页 |
| 4.4.2 样品制备 | 第69页 |
| 4.4.3 样品中总RNA的提取 | 第69-70页 |
| 4.4.4 样品中总RNA的检测 | 第70页 |
| 4.4.5 文库构建与测序 | 第70页 |
| 4.4.6 测序数据质量评估 | 第70页 |
| 4.4.7 基因表达水平分析 | 第70页 |
| 4.4.8 差异基因表达分析 | 第70页 |
| 4.4.9 差异基因GO和 KEGG富集分析 | 第70页 |
| 4.4.10 qRT-PCR验证RNA-Seq | 第70页 |
| 4.5 实验结果 | 第70-81页 |
| 4.5.1 RNA-seq的质控分析 | 第70-71页 |
| 4.5.2 RNA-seq整体质量评估 | 第71-72页 |
| 4.5.3 差异表达基因分析 | 第72-74页 |
| 4.5.4 差异基因聚类分析 | 第74-75页 |
| 4.5.5 差异基因GO富集分析 | 第75-77页 |
| 4.5.6 KEGG通路分析 | 第77-81页 |
| 4.5.7 qPCR验证RNA-Seq | 第81页 |
| 4.6 讨论和结论 | 第81-85页 |
| 第五章 MSTN通过BNIP2-CDC42-p38MAPK信号通路促进成肌细胞分化 | 第85-101页 |
| 5.1 前言 | 第85页 |
| 5.2 实验材料 | 第85-88页 |
| 5.2.1 仪器 | 第85-86页 |
| 5.2.2 试剂及耗材 | 第86页 |
| 5.2.3 抗体 | 第86页 |
| 5.2.4 质粒和菌株 | 第86-88页 |
| 5.2.5 细胞株和培养基 | 第88页 |
| 5.3 实验方法 | 第88-93页 |
| 5.3.1 载体构建 | 第88-90页 |
| 5.3.2 陕北白绒山羊骨骼肌成肌细胞分离培养 | 第90页 |
| 5.3.3 慢病毒包装 | 第90页 |
| 5.3.4 慢病毒滴度测定-荧光法测定病毒滴度 | 第90-91页 |
| 5.3.5 慢病毒感染山羊原代成肌细胞的转染效率及稳定过表达FST细胞株的筛选 | 第91-92页 |
| 5.3.6 C2C12 细胞和山羊成肌细胞分化 | 第92页 |
| 5.3.7 qRT-PCR | 第92页 |
| 5.3.8 免疫共沉淀 | 第92-93页 |
| 5.3.9 Western Blot检测 | 第93页 |
| 5.3.10 统计分析 | 第93页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第93-100页 |
| 5.4.1 构建p CD513B-CMV-FST重组慢病毒载体 | 第93-95页 |
| 5.4.2 重组慢病毒的过表达和滴度测定 | 第95-96页 |
| 5.4.3 重组慢病毒对山羊成肌细胞感染效率的测定 | 第96页 |
| 5.4.4 FST基因在山羊成肌细胞中的表达情况 | 第96-97页 |
| 5.4.5 MSTN、CDC42和BNIP2 之间的相互作用 | 第97-100页 |
| 5.5 讨论 | 第100-101页 |
| 第六章 MSTN功能突变失活可促进C2C12 细胞线粒体生成 | 第101-116页 |
| 6.1 前言 | 第101页 |
| 6.2 实验材料 | 第101-103页 |
| 6.2.1 实验试剂 | 第101-102页 |
| 6.2.2 主要仪器及耗材 | 第102-103页 |
| 6.2.3 抗体 | 第103页 |
| 6.2.4 实验材料 | 第103页 |
| 6.3 试验方法 | 第103-108页 |
| 6.3.1 细胞复苏、培养与冻存 | 第103页 |
| 6.3.2 细胞基因组DNA提取 | 第103页 |
| 6.3.3 细胞RNA提取和qRT-PCR | 第103页 |
| 6.3.4 线粒体DNA拷贝数测定(mtDNA/ntDNA) | 第103-104页 |
| 6.3.5 细胞线粒体膜电位检测 | 第104-105页 |
| 6.3.6 MitoTracker? Red CMXRos和 MitoTracker Green标定成肌细胞线粒体 | 第105-106页 |
| 6.3.7 葡萄糖吸收检测 | 第106页 |
| 6.3.8 活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测 | 第106页 |
| 6.3.9 ATP检测 | 第106页 |
| 6.3.10 乳酸测定 | 第106-108页 |
| 6.3.11 细胞蛋白提取及Western Blot | 第108页 |
| 6.3.12 统计分析 | 第108页 |
| 6.4 实验结果 | 第108-113页 |
| 6.4.1 MSTN KO可以促进线粒体的生成 | 第108-110页 |
| 6.4.2 MSTN KO可以调节线粒体能量代谢 | 第110-111页 |
| 6.4.3 MSTN基因敲除没有诱导线粒体损伤 | 第111-113页 |
| 6.5 讨论和结论 | 第113-116页 |
| 第七章 结论 | 第116-118页 |
| 7.1 总结 | 第116页 |
| 7.2 创新点 | 第116-117页 |
| 7.3 还需进一步研究的问题 | 第117-118页 |
| 附录 | 第118-142页 |
| 参考文献 | 第142-156页 |
| 致谢 | 第156-157页 |
| 个人简历 | 第157-158页 |
