| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4-5页 |
| 前言 | 第9-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 耶式解脂酵母简介 | 第11-13页 |
| 1.1.1 耶式解脂酵母分子生物学特征 | 第11-12页 |
| 1.1.2 耶氏解脂酵母代谢表达系统 | 第12页 |
| 1.1.3 耶式解脂酵母的应用 | 第12-13页 |
| 1.1.4 耶式解脂酵母基因研究手段 | 第13页 |
| 1.2 CRISPR系统 | 第13-19页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas的基因座结构和组成 | 第15-16页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第16-17页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9技术 | 第17页 |
| 1.2.5 CRISPR/Cpf1技术 | 第17-18页 |
| 1.2.6 CRISPRi技术 | 第18-19页 |
| 1.3 本课题的研究内容与思路 | 第19-21页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第21-41页 |
| 2.1 实验菌株 | 第21-28页 |
| 2.2 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.3 实验试剂和培养基配制 | 第29-31页 |
| 2.3.1 实验试剂 | 第29页 |
| 2.3.2 培养基配制 | 第29-30页 |
| 2.3.3 生化试剂配制 | 第30-31页 |
| 2.4 DNA操作方法 | 第31-37页 |
| 2.4.1 引物 | 第31-34页 |
| 2.4.2 目标PCR产物的扩增与回收 | 第34-35页 |
| 2.4.3 酶切与连接 | 第35页 |
| 2.4.4 Golden-gate一步组装 | 第35页 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第35-36页 |
| 2.4.6 大肠杆菌转化子的筛选及质粒提取 | 第36-37页 |
| 2.5 耶式解脂酵母的转化及筛选方法 | 第37页 |
| 2.5.1 耶式解脂酵母的转化方法 | 第37页 |
| 2.5.2 耶式解脂酵母菌落PCR方法 | 第37页 |
| 2.6 菌株发酵条件 | 第37-38页 |
| 2.7 荧光菌株拍照与荧光强度测量 | 第38-39页 |
| 2.7.1 荧光菌株拍照 | 第38页 |
| 2.7.2 荧光强度测量 | 第38-39页 |
| 2.8 紫色杆菌素测定 | 第39页 |
| 2.8.1 紫色杆菌素的提取与测量 | 第39页 |
| 2.8.2 紫色杆菌素标准曲线 | 第39页 |
| 2.9 实时定量PCR(qRT-PCR) | 第39-41页 |
| 第3章 CRISPRi系统在解脂酵母中的初步建立 | 第41-53页 |
| 3.1 CRISPRi/dCas9与CRISPRi/dCpf1系统的构建 | 第41-42页 |
| 3.2 两种reporter系统的构建 | 第42-46页 |
| 3.2.1 荧光reporter系统的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.2 PVA reporter系统的构建 | 第45-46页 |
| 3.3 CRISPRi在解脂酵母中的功能检测 | 第46-52页 |
| 3.3.1 CRISPRi/dCas9与CRISPRi/dCpf1抑制荧光蛋白表达 | 第46-50页 |
| 3.3.2 CRISPRi/dCas9与CRISPRi/dCpf1抑制紫色杆菌素生产 | 第50-52页 |
| 3.4 小结 | 第52-53页 |
| 第4章 CRISPRi系统在解脂酵母中的初步优化 | 第53-63页 |
| 4.1 dCpf1-KRAB与 dCas9-KRAB系统的建立 | 第53-56页 |
| 4.1.1 dCpf1-KRAB与dCas9-KRAB抑制荧光蛋白表达 | 第54-56页 |
| 4.2 dCas9-Mxi1系统的建立 | 第56-57页 |
| 4.2.1 dCas9-Mxi1抑制荧光蛋白表达 | 第56-57页 |
| 4.3 无规律现象探究 | 第57-61页 |
| 4.3.1 CRISPRi系统对内源基因(pex10)的抑制 | 第57-59页 |
| 4.3.2 初步探究 | 第59-61页 |
| 4.4 小结 | 第61-63页 |
| 第5章 多点抑制策略在解脂酵母中的开发与应用 | 第63-75页 |
| 5.1 多点CRISPRi系统的构建 | 第63-65页 |
| 5.2 多点CRISPRi系统在解脂酵母中的功能检测 | 第65-69页 |
| 5.2.1 多点CRISPRi系统抑制荧光蛋白表达 | 第66-69页 |
| 5.3 利用多点CRISPRi系统抑制多个基因 | 第69-73页 |
| 5.3.1 多点CRISPRi系统在PVA代谢路径中的应用 | 第69-70页 |
| 5.3.2 多点CRISPRi系统同时扰动荧光表达与色素积累 | 第70-73页 |
| 5.4 小结 | 第73-75页 |
| 第6章 结论与展望 | 第75-77页 |
| 6.1 结论 | 第75-76页 |
| 6.2 展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第85-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
