| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 文献综述 | 第14-34页 |
| 第一章 转基因动物的应用 | 第14-21页 |
| 1.1 利用转基因动物乳腺生产药用蛋白 | 第14-15页 |
| 1.2 转基因家畜在农业方面的应用 | 第15-18页 |
| 1.2.1 利用转基因家畜提高动物的生产性能 | 第15页 |
| 1.2.2 动物转基因抗病育种 | 第15-18页 |
| 1.3 转基因动物生产技术 | 第18-21页 |
| 1.3.1 体细胞核移植技术 | 第18页 |
| 1.3.2 慢病毒介导的转基因技术 | 第18页 |
| 1.3.3 条件性转基因表达 | 第18页 |
| 1.3.4 人工染色体载体 | 第18-19页 |
| 1.3.5 精原细胞介导的转基因技术 | 第19页 |
| 1.3.6 RNA 干扰 | 第19页 |
| 1.3.7 锌指核酸酶技术 | 第19-21页 |
| 第二章 PhiC31 整合酶介导的位点特异性整合 | 第21-34页 |
| 2.1 位点特异性重组酶 | 第21-23页 |
| 2.2 PhiC31 整合酶的整合机理及在其它生物中的优化 | 第23-26页 |
| 2.3 PhiC31 整合酶在不同生物中的应用 | 第26-29页 |
| 2.3.1 PhiC31 整合酶在植物中的应用 | 第26页 |
| 2.3.2 PhiC31 整合酶在非脊椎动物中的应用 | 第26-27页 |
| 2.3.3 PhiC31 整合酶在脊椎动物中的应用 | 第27-29页 |
| 2.4 PhiC31 整合酶在治疗学方面的应用 | 第29-31页 |
| 2.4.1 PhiC31 整合酶在 in vito 基因治疗中的研究 | 第29-30页 |
| 2.4.2 PhiC31 整合酶在 ex vivo 基因治疗中的研究 | 第30-31页 |
| 2.5 PhiC31 整合酶在多能干细胞中的应用 | 第31-32页 |
| 2.6 PhiC31 整合酶系统的安全性 | 第32-33页 |
| 2.7 PhiC31 整合酶联合其他重组酶的应用前景 | 第33-34页 |
| 试验研究 | 第34-101页 |
| 第三章 基于假 attP 位点整合的通用型表达载体构建及功能验证 | 第34-48页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第34-35页 |
| 3.1.1 材料 | 第34页 |
| 3.1.2 试剂 | 第34-35页 |
| 3.2 方法 | 第35-40页 |
| 3.2.1 通过重叠延伸 PCR 合成载体元件 | 第35-36页 |
| 3.2.2 一种基于假 attP 位点整合的通用型表达载体的构建 | 第36-37页 |
| 3.2.3 attB 序列功能评估 | 第37-40页 |
| 3.2.4 双荧光报告系统功能验证 | 第40页 |
| 3.3 结果 | 第40-45页 |
| 3.3.1 attB 片段、LoxP2 片段和 MCS 片段的凝胶电泳检测 | 第40-41页 |
| 3.3.2 通用型表达载体 pARNG 的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.3.3 attB 序列在 HEK293 细胞中的位点特异性整合 | 第42-44页 |
| 3.3.4 双荧光报告系统在 HEK293 细胞上的功能验证 | 第44-45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 利用 phiC31 整合酶 mRNA 生产转基因胎牛成纤维细胞 | 第48-71页 |
| 4.1 材料和试剂 | 第48-49页 |
| 4.1.1 材料 | 第48-49页 |
| 4.1.2 试剂 | 第49页 |
| 4.2 方法 | 第49-55页 |
| 4.2.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的原代培养与性别鉴定 | 第49-50页 |
| 4.2.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的制备 | 第50页 |
| 4.2.3 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证及转染优化 | 第50-52页 |
| 4.2.4 HBD3 乳腺特异性表达载体构建及转染胎牛成纤维细胞 | 第52-53页 |
| 4.2.5 稳定转染细胞克隆的鉴定 | 第53-55页 |
| 4.2.6 数据统计 | 第55页 |
| 4.3 结果 | 第55-68页 |
| 4.3.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定 | 第55页 |
| 4.3.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的体外转录 | 第55-56页 |
| 4.3.3 PhiC31 整合酶功能验证载体构建及功能验证 | 第56-57页 |
| 4.3.4 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证 | 第57-59页 |
| 4.3.5 PhiC31 整合酶 mRNA 转染对胎牛成纤维细胞的潜在毒性 | 第59-60页 |
| 4.3.6 HBD3 乳腺特异性表达载体的构建及稳定转染单克隆细胞的获得 | 第60-62页 |
| 4.3.7 稳定转染的胎牛成纤维细胞克隆的鉴定 | 第62-68页 |
| 4.4 讨论 | 第68-70页 |
| 4.5 小结 | 第70-71页 |
| 第五章 利用 Cre 穿膜肽切除转基因细胞中的抗性筛选标记 | 第71-89页 |
| 5.1 材料与试剂 | 第71-72页 |
| 5.1.1 材料 | 第71-72页 |
| 5.1.2 试剂 | 第72页 |
| 5.2 方法 | 第72-77页 |
| 5.2.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化 | 第72-73页 |
| 5.2.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白转导胎牛成纤维细胞的优化 | 第73-74页 |
| 5.2.3 用流式细胞术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞 | 第74页 |
| 5.2.4 无抗生素筛选标记的转基因细胞的鉴定 | 第74-77页 |
| 5.2.5 数据统计 | 第77页 |
| 5.3 结果 | 第77-86页 |
| 5.3.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化 | 第77-78页 |
| 5.3.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白对胎牛成纤维细胞转导条件的优化 | 第78-82页 |
| 5.3.3 基于 FACS 技术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞 | 第82-84页 |
| 5.3.4 FACS 分选的转基因细胞的鉴定 | 第84-86页 |
| 5.4 讨论 | 第86-87页 |
| 5.5 小结 | 第87-89页 |
| 第六章 通过 SCNT 生产无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因克隆牛 | 第89-101页 |
| 6.1 材料与试剂 | 第89-90页 |
| 6.1.1 试验动物 | 第89页 |
| 6.1.2 试剂 | 第89-90页 |
| 6.2 方法 | 第90-92页 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集、成熟培养和去核 | 第90页 |
| 6.2.2 无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因的胎牛成纤维细胞的准备 | 第90页 |
| 6.2.3 核移植及转基因克隆胚获得 | 第90页 |
| 6.2.4 转基因克隆胚 PCR 检测 | 第90页 |
| 6.2.5 转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定 | 第90-91页 |
| 6.2.6 转基因牛的 Southern blot 鉴定 | 第91页 |
| 6.2.7 转基因牛乳汁采集和成分分析 | 第91页 |
| 6.2.8 HBD3 在转基因牛乳汁中的表达分析 | 第91页 |
| 6.2.9 转基因牛乳汁中重组 HBD3 的体外抗菌活性检测 | 第91-92页 |
| 6.2.10 乳腺表达 HBD3 转基因牛的攻菌实验 | 第92页 |
| 6.2.11 数据统计 | 第92页 |
| 6.3 结果 | 第92-99页 |
| 6.3.1 转基因克隆胚的获得与鉴定 | 第92-93页 |
| 6.3.2 SCNT 效率及转基因胚胎发育情况 | 第93-95页 |
| 6.3.3 转基因克隆牛的获得与 Southern blot 鉴定 | 第95页 |
| 6.3.4 转基因牛乳汁成分分析 | 第95-96页 |
| 6.3.5 转基因牛乳汁中 HBD3 的表达 | 第96-97页 |
| 6.3.6 转基因牛乳体外抑菌活性 | 第97-98页 |
| 6.3.7 转基因牛攻菌实验结果 | 第98-99页 |
| 6.4 讨论 | 第99-100页 |
| 6.5 小结 | 第100-101页 |
| 全文结论 | 第101-102页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-118页 |
| 附录 | 第118-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 个人简介 | 第121页 |
