| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-16页 |
| 缩略语表 | 第17-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-37页 |
| 1.1 核苷类第二信使 | 第19-33页 |
| 1.1.1 核苷类第二信使的种类 | 第19-20页 |
| 1.1.2 c-di-AMP | 第20-25页 |
| 1.1.2.1 c-di-AMP的合成、降解与转运 | 第20-21页 |
| 1.1.2.2 c-di-AMP细菌胞内受体与相关信号传导途径 | 第21-24页 |
| 1.1.2.3 真核细胞c-di-AMP效应蛋白 | 第24-25页 |
| 1.1.2.4 研究c-di-AMP信号途径的意义 | 第25页 |
| 1.1.3 c-di-GMP | 第25-33页 |
| 1.1.3.1 c-di-GMP的发现 | 第25-26页 |
| 1.1.3.2 c-di-GMP合成酶 | 第26页 |
| 1.1.3.3 c-di-GMP降解酶 | 第26-27页 |
| 1.1.3.4 双功能蛋白 | 第27-28页 |
| 1.1.3.5 c-di-GMP细菌胞内受体 | 第28页 |
| 1.1.3.6 c-di-GMP真核细胞受体 | 第28-30页 |
| 1.1.3.7 c-di-GMP对细菌运动的调控控制 | 第30-33页 |
| 1.2 生物素 | 第33-36页 |
| 1.2.1 生物素 | 第33页 |
| 1.2.2 细菌生物素合成与转运 | 第33-34页 |
| 1.2.3 生物素调节系统 | 第34-36页 |
| 1.3 研究目的和意义 | 第36-37页 |
| 1.3.1 c-di-AMP所介导细菌-宿主相互作用 | 第36页 |
| 1.3.2 PstA靶标蛋白的鉴定 | 第36页 |
| 1.3.3 c-di-GMP受体RNA的鉴定 | 第36页 |
| 1.3.4 鉴定新的生物素调控途径 | 第36-37页 |
| 第二章 核苷类第二信使c-di-AMP对金黄色葡萄球菌小菌落突变体代谢和感染的调控研究 | 第37-84页 |
| 2.1 研究背景 | 第37-44页 |
| 2.1.1 金黄色葡萄球菌 | 第37页 |
| 2.1.2 S. aureus小菌落突变体 | 第37-39页 |
| 2.1.2.1 血红素和甲萘醌依赖型S. aureus SCV | 第37-38页 |
| 2.1.2.2 胸腺嘧啶核苷依赖型S. aureus SCV | 第38-39页 |
| 2.1.3 囊性纤维化 | 第39-41页 |
| 2.1.3.1 囊性纤维化病人的呼吸道感染和炎症 | 第39-40页 |
| 2.1.3.2 S. aureus TD-SCV引起囊性纤维化病人严重的呼吸道疾病 | 第40-41页 |
| 2.1.4 天然免疫反应 | 第41-42页 |
| 2.1.5 胞质DNA和微生物环二核苷单磷酸诱导的天然免疫反应 | 第42-43页 |
| 2.1.6 c-di-AMP信号调控在S. aureus中的研究进展 | 第43-44页 |
| 2.1.6.1 c-di-AMP的合成与降解 | 第43-44页 |
| 2.1.6.2 c-di-AMP受体蛋白与信号传导途径 | 第44页 |
| 2.2 本研究的目的和意义 | 第44-46页 |
| 2.2.1 研究S. aureus及S. aureus TD-SCV感染特性及相关机制 | 第44-45页 |
| 2.2.2 S. aureus TD-SCV c-di-AMP诱导宿主天然免疫反应 | 第45页 |
| 2.2.3 鉴定PstA靶标蛋白 | 第45页 |
| 2.2.4 c-di-AMP/PstA参与thymidine利用 | 第45-46页 |
| 2.3 材料与方法 | 第46-61页 |
| 2.3.1 材料 | 第46-47页 |
| 2.3.1.1 重要试剂 | 第46页 |
| 2.3.1.2 培养基与常见溶液的配制 | 第46-47页 |
| 2.3.1.3 实验动物 | 第47页 |
| 2.3.1.4 菌株与质粒 | 第47页 |
| 2.3.2 实验方法 | 第47-61页 |
| 2.3.2.1 分子生物学基本操作 | 第47-51页 |
| 2.3.2.2 S. aureus培养与生长曲线测定 | 第51页 |
| 2.3.2.3 S. aureus基因敲除 | 第51-53页 |
| 2.3.2.4 细胞培养 | 第53页 |
| 2.3.2.5 S. aureus感染小鼠巨噬细胞和胞内生长曲线测定 | 第53-54页 |
| 2.3.2.6 巨噬细胞RNA提取与cDNA制备 | 第54页 |
| 2.3.2.7 乳酸脱氢酶活性测定 | 第54页 |
| 2.3.2.8 荧光定量PCR | 第54-55页 |
| 2.3.2.9 Taqman array | 第55页 |
| 2.3.2.10 IFNβ 蛋白测定 | 第55-56页 |
| 2.3.2.11 细菌胞内c-di-AMP的提取 | 第56页 |
| 2.3.2.12 巨噬细胞内c-di-AMP的提取 | 第56页 |
| 2.3.2.13 S. aureus感染小鼠的方法 | 第56-57页 |
| 2.3.2.14 肺组织RNA的提取和cDNA的制备 | 第57页 |
| 2.3.2.15 S. aureus细胞膜电位测定 | 第57页 |
| 2.3.2.16 细菌双杂交实验 | 第57-59页 |
| 2.3.2.17 β-半乳糖苷酶活性测定 | 第59页 |
| 2.3.2.18 利用DRaCALA实验探究蛋白与c-di-AMP的结合能力 | 第59页 |
| 2.3.2.19 胸腺嘧啶核苷酸激酶活性测定 | 第59-61页 |
| 2.3.2.20 S. aureus基因组突变率测定 | 第61页 |
| 2.4 结果与分析 | 第61-79页 |
| 2.4.1 金黄色葡萄球菌小菌落突变体诱导高炎症反应的机理研究 | 第61-73页 |
| 2.4.1.1 ΔthyA和 ΔhemB突变菌株构建 | 第61页 |
| 2.4.1.2 ?thyA、?hemB和WT生长曲线测定 | 第61-62页 |
| 2.4.1.3 ΔthyA、ΔhemB和野生型 (WT) S. aureus Newman菌株在小鼠骨髓巨噬细胞内显示不同的存活能力 | 第62-63页 |
| 2.4.1.4 ΔthyA、ΔhemB和WT菌株对iBMDM的感染复数优化 | 第63-64页 |
| 2.4.1.5 被 ΔthyA感染的巨噬细胞产生更强的炎症反应 | 第64-65页 |
| 2.4.1.6 S. aureus诱导的炎症反应通路预测 | 第65-66页 |
| 2.4.1.7 ΔthyA特异性激活STING依赖性I型干扰素的表达 | 第66-67页 |
| 2.4.1.8 临床分离TD-SCV产生高含量的c-di-AMP | 第67页 |
| 2.4.1.9 Thymidine控制 ΔthyA胞内c-di-AMP浓度 | 第67-68页 |
| 2.4.1.10 被 ΔthyA感染的iBMDM含有高浓度c-di-AMP激活IFN应答 | 第68-69页 |
| 2.4.1.11 肺的炎症反应影响S. aureus在肺中的存活 | 第69-70页 |
| 2.4.1.12 ?thyA诱导肺组织STING依赖型炎症反应 | 第70-71页 |
| 2.4.1.13 ?thyA诱导的炎症反应不由cGAS主导 | 第71页 |
| 2.4.1.14 TD-SCV的高突变率或帮助细菌的持续性感染 | 第71-72页 |
| 2.4.1.15 TD-SCV引起小鼠严重肺感染的分子机制 | 第72-73页 |
| 2.4.2 c-di-AMP对S. aureus TD-SCV利用胸腺嘧啶核苷的调控机制研究 | 第73-79页 |
| 2.4.2.1 c-di-AMP对TD-SCV吸收胸腺嘧啶核苷的调控作用 | 第73-74页 |
| 2.4.2.2 c-di-AMP受体蛋白PstA与胸腺嘧啶核苷酸激酶编码基因在基因组上毗邻 | 第74页 |
| 2.4.2.3 c-di-AMP受体蛋白PstA与胸腺嘧啶核苷酸激酶TMK互作 | 第74-75页 |
| 2.4.2.4 PstA c-di-AMP结合位点突变蛋白构建 | 第75-76页 |
| 2.4.2.5 PstA与TMK的相互作用依赖c-di-AMP | 第76页 |
| 2.4.2.6 PstA促进TMK的活力 | 第76-78页 |
| 2.4.2.7 pstA基因缺失导致 ΔthyA利用胸腺嘧啶核苷的能力降低 | 第78页 |
| 2.4.2.8 pstA基因缺失不影响 ΔthyA对胸腺嘧啶核苷的吸收 | 第78-79页 |
| 2.4.2.9 c-di-AMP对胸腺嘧啶核苷利用的调控机制 | 第79页 |
| 2.5 讨论 | 第79-82页 |
| 2.5.1 c-di-AMP可能影响PstA的聚体形式 | 第79-80页 |
| 2.5.2 c-di-AMP广泛参与细菌的中心代谢途径 | 第80页 |
| 2.5.3 S. aureus TD-SCV产生高浓度c-di-AMP的机制 | 第80-82页 |
| 2.5.4 c-di-AMP如何进入宿主细胞内 | 第82页 |
| 2.6 小结 | 第82-84页 |
| 第三章 苏云金芽胞杆菌c-di-GMP核糖开关Bc2 RNA的调控机制研究 | 第84-116页 |
| 3.1 研究背景 | 第84-89页 |
| 3.1.1 苏云金芽胞杆菌 | 第84页 |
| 3.1.2 核糖开关 | 第84-86页 |
| 3.1.2.1 核糖开关的结构与调节机制 | 第84-86页 |
| 3.1.2.2 核糖开关的种类 | 第86页 |
| 3.1.3 c-di-GMP核糖开关 | 第86-89页 |
| 3.1.3.1 I类c-di-GMP核糖开关的结构 | 第86页 |
| 3.1.3.2 c-di-GMP-I和c-di-GMP-II核糖开关的比较 | 第86-88页 |
| 3.1.3.3 c-di-GMP核糖开关的调控机制 | 第88-89页 |
| 3.1.4 胶原粘附蛋白 | 第89页 |
| 3.2 本研究的目的和意义 | 第89-90页 |
| 3.2.1 鉴定c-di-GMP核糖开关 | 第89页 |
| 3.2.2 阐明c-di-GMP核糖开关的调控机制 | 第89-90页 |
| 3.2.3 探究c-di-GMP核糖开关的生理功能 | 第90页 |
| 3.2.4 探究胶原粘附蛋白的生理功能 | 第90页 |
| 3.3 材料与方法 | 第90-101页 |
| 3.3.1 材料 | 第90页 |
| 3.3.1.1 菌株、质粒与引物 | 第90页 |
| 3.3.1.2 培养基和抗生素 | 第90页 |
| 3.3.2 试剂与器材 | 第90-94页 |
| 3.3.2.1 常用试剂和耗材 | 第90-91页 |
| 3.3.2.2 常用溶液的配制 | 第91-93页 |
| 3.3.2.3 主要仪器 | 第93-94页 |
| 3.3.3 方法 | 第94-101页 |
| 3.3.3.1 分子生物学基本操作 | 第94页 |
| 3.3.3.2 菌株培养 | 第94页 |
| 3.3.3.3 B. thuringiensis感受态细胞的制备及电转化 | 第94-95页 |
| 3.3.3.4 归巢内切酶I-SceI介导的基因敲除方法 | 第95-97页 |
| 3.3.3.5 细菌mRNA提取、cDNA合成以及荧光定量PCR | 第97页 |
| 3.3.3.6 β-半乳糖苷酶活性的测定 | 第97-98页 |
| 3.3.3.7 体外转录终止实验 | 第98-99页 |
| 3.3.3.8 胞内c-di-GMP提取 | 第99页 |
| 3.3.3.9 LC-MS/MS定量分析c-di-GMP | 第99-100页 |
| 3.3.3.10 菌体运动性检测 (swarming assay) | 第100页 |
| 3.3.3.11 胞外多糖定量分析 | 第100页 |
| 3.3.3.12 扫描电镜 | 第100页 |
| 3.3.3.13 生物被膜培养与定量分析 | 第100-101页 |
| 3.3.3.14 苏云金芽胞杆菌沉降速率测定 | 第101页 |
| 3.3.3.15 苏云金芽孢杆菌感染棉铃虫实验 | 第101页 |
| 3.3.3.16 生物信息学分析 | 第101页 |
| 3.4 结果与分析 | 第101-112页 |
| 3.4.0 Bc群属菌株中c-di-GMP核糖开关的分布 | 第101-102页 |
| 3.4.1 Bc2 RNA序列分析与二级结构预测 | 第102-103页 |
| 3.4.2 Bc2 RNA抑制cap基因表达 | 第103-104页 |
| 3.4.3 c-di-GMP结合Bc2 RNA后促进cap的转录 | 第104-105页 |
| 3.4.4 c-di-GMP特异性促进Bc2 RNA的转录通读 | 第105-106页 |
| 3.4.5 c-di-GMP高浓度和低浓度突变菌株胞内c-di-GMP含量测定 | 第106-107页 |
| 3.4.6 胞内高浓度的c-di-GMP促进cap基因的表达 | 第107页 |
| 3.4.7 Bc2 RNA对cap基因表达的调控机制 | 第107-108页 |
| 3.4.8 Cap超表达抑制B. thuringiensis的运动 | 第108-109页 |
| 3.4.9 高浓度Cap抑制胞外多糖的形成 | 第109页 |
| 3.4.10 Cap促进B. thuringiensis沉降 | 第109-110页 |
| 3.4.11 高浓度的Cap抑制生物被膜形成 | 第110页 |
| 3.4.12 Cap和生物被膜共同影响B. thuringiensis对棉铃虫的毒力 | 第110-112页 |
| 3.5 讨论 | 第112-114页 |
| 3.5.1 B. thuringiensis中c-di-GMP代谢相关蛋白的丰富性 | 第112页 |
| 3.5.2 Bc2 RNA通过抑制/去抑制模式调节下游基因表达 | 第112-113页 |
| 3.5.3 Bc2 RNA是Bc群中首个被实验验证的c-di-GMP核糖开关 | 第113页 |
| 3.5.4 Cap是一个多功能蛋白 | 第113-114页 |
| 3.5.5 B. thuringiensis BMB171中存在丰富的核糖开关 | 第114页 |
| 3.6 小结 | 第114-116页 |
| 第四章 转录调控因子BioQ对生物素合成调控的研究 | 第116-151页 |
| 4.1 研究背景 | 第116-122页 |
| 4.1.1 结核分枝杆菌和结核病 | 第116页 |
| 4.1.2 耐药性结核分枝杆菌 | 第116-117页 |
| 4.1.3 抗结核药物开发研究现状 | 第117-118页 |
| 4.1.4 结核分枝杆菌生物素代谢系统 | 第118-119页 |
| 4.1.5 结核分枝杆菌生物素调节系统 | 第119-120页 |
| 4.1.6 细菌生物素代谢通路与抗微生物药物开发 | 第120-121页 |
| 4.1.7 TetR家族转录调控因子 | 第121-122页 |
| 4.1.7.1 TetR家族转录调控因子的结构 | 第121-122页 |
| 4.1.7.2 家族转录调控因子识别DNA的分子机制 | 第122页 |
| 4.2 研究的目的和意义 | 第122-123页 |
| 4.2.1 生物素代谢基因转录情况分析 | 第122页 |
| 4.2.2 鉴定了新的生物素合成调控途径 | 第122页 |
| 4.2.3 TetR家族转录调控因子BioQ DNA识别位点的鉴定 | 第122-123页 |
| 4.3 材料与方法 | 第123-134页 |
| 4.3.1 材料 | 第123-127页 |
| 4.3.1.1 菌株、质粒与引物 | 第123页 |
| 4.3.1.2 培养基和抗生素 | 第123-127页 |
| 4.3.1.3 常用试剂和耗材 | 第127页 |
| 4.3.1.4 常用溶液的配制 | 第127页 |
| 4.3.1.5 主要仪器 | 第127页 |
| 4.3.2 方法 | 第127-134页 |
| 4.3.2.1 分子生物学基本操作 | 第127-128页 |
| 4.3.2.2 菌株培养 | 第128页 |
| 4.3.2.3 M. segmatis感受态细胞的制备及电转化 | 第128页 |
| 4.3.2.4 凝胶阻滞实验 | 第128-129页 |
| 4.3.2.5 DNase I足迹实验 | 第129-130页 |
| 4.3.2.6 细菌单杂实验 | 第130页 |
| 4.3.2.7 M. segmatis基因敲除 | 第130-131页 |
| 4.3.2.8 β-半乳糖苷酶活性实验 | 第131页 |
| 4.3.2.9 RNA抽提、RT-PCR和qRT-PCR | 第131-132页 |
| 4.3.2.10 5′-RACE | 第132-133页 |
| 4.3.2.11 化学交联实验 | 第133页 |
| 4.3.2.12 分析超速离心实验 | 第133页 |
| 4.3.2.13 Protein shfiting实验 | 第133-134页 |
| 4.4 结果与分析 | 第134-147页 |
| 4.4.1 BioQ是在分枝杆菌中广泛存在的Tet R家族转录调控因子 | 第134-135页 |
| 4.4.2 BioQ蛋白特性研究 | 第135-136页 |
| 4.4.3 bioQ及生物素合成操纵子基因结构研究 | 第136-137页 |
| 4.4.4 bioQ及生物素合成基因转录起始位点确定 | 第137-139页 |
| 4.4.5 探究BioQ的结合靶标 | 第139页 |
| 4.4.6 BioQ结合位点分析 | 第139-140页 |
| 4.4.7 BioQ特异性识别并结合生物素合成操纵子的启动子区域 | 第140-142页 |
| 4.4.8 BioQ结合DNA的最短序列分析 | 第142页 |
| 4.4.9 Asp23和Arg27是BioQ结合DNA的关键氨基酸位点 | 第142页 |
| 4.4.10 BioQ作为转录抑制因子发挥功能 | 第142-144页 |
| 4.4.11 BioQ受生物素浓度的调控 | 第144-145页 |
| 4.4.12 生物素不直接影响BioQ对DNA的结合 | 第145-146页 |
| 4.4.13 BioQ配基探究 | 第146-147页 |
| 4.5 讨论 | 第147-148页 |
| 4.6 小结 | 第148-151页 |
| 第五章 总结和展望 | 第151-154页 |
| 5.1 总结 | 第151-152页 |
| 5.1.1 S. aureus TD-SCV产生高浓度的c-di-AMP激活宿主天然免疫反应 | 第151页 |
| 5.1.2 c-di-AMP调控细菌细菌胸腺嘧啶核苷的利用 | 第151页 |
| 5.1.3 c-di-GMP核糖开关Bc2 RNA调控细菌运动新途径 | 第151-152页 |
| 5.1.4 TetR家族转录抑制因子对分枝杆菌生物素合成基因的调控机制 | 第152页 |
| 5.2 展望 | 第152-154页 |
| 5.2.1 环二核苷单磷酸 (c-di-NMP) 是重要的免疫佐剂 | 第152-153页 |
| 5.2.2 STING蛋白抑制剂有望控制宿主炎症反应 | 第153页 |
| 5.2.3 c-di-GMP核糖开关是Bacillus重要的调控原件 | 第153页 |
| 5.2.4 BioQ配基分子的鉴定 | 第153-154页 |
| 参考文献 | 第154-169页 |
| 附录：论文发表和待发表情况 | 第169-170页 |
| 致谢 | 第170-172页 |
