| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 第一章 综述 | 第14-34页 |
| 1.1 肝素和肝素前体 | 第14-15页 |
| 1.2 低分子量肝素的制备 | 第15-16页 |
| 1.3 肝素酶 | 第16-19页 |
| 1.3.1 Heparinase Ⅰ | 第16-17页 |
| 1.3.2 Heparinase Ⅲ | 第17-19页 |
| 1.4 合成E coli K5脂多糖外核关键基因waaR简介 | 第19-20页 |
| 1.4.1 大肠杆菌脂多糖结构 | 第19-20页 |
| 1.4.2 waaR影响荚膜多糖在K5细胞表面留存研究 | 第20页 |
| 1.5 Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用 | 第20-26页 |
| 1.5.1 Red同源重组作用机理 | 第20-21页 |
| 1.5.2 几种不同的Red同源重组技术 | 第21-26页 |
| 1.5.2.1 两步同源重组法 | 第21-24页 |
| 1.5.2.2 gene gorging法 | 第24-25页 |
| 1.5.2.3 gene doctoring法 | 第25-26页 |
| 1.6 本课题的研究内容 | 第26-27页 |
| 参考文献 | 第27-34页 |
| 第二章 Heparinase Ⅰ的表达、纯化及应用 | 第34-50页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 实验材料 | 第34-40页 |
| 2.2.1 菌株 | 第34-35页 |
| 2.2.2 实验药品 | 第35-36页 |
| 2.2.3 培养基及缓冲液 | 第36-38页 |
| 2.2.3.1 蛋白诱导所需试剂 | 第36-37页 |
| 2.2.3.2 SDS-PAGE缓冲液 | 第37页 |
| 2.2.3.3 Ni-NTA柱层析缓冲液 | 第37-38页 |
| 2.2.3.4 糖电泳缓冲液 | 第38页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第38-40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-44页 |
| 2.3.1 Heparinase Ⅰ工程菌的诱导表达 | 第40页 |
| 2.3.2 HepⅠ粗酶的收获 | 第40页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳检验 | 第40-41页 |
| 2.3.4 酶的分离、纯化与电泳鉴定 | 第41-42页 |
| 2.3.5 蛋白含量测定 | 第42页 |
| 2.3.6 HeparinaseⅠ酶活的测定 | 第42-44页 |
| 2.3.7 HeparinaseⅠ应用于Heparin的解聚 | 第44页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第44-48页 |
| 2.4.1 HeparinaseⅠ的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.4.2 HeparinaseⅠ的分离、纯化与酶活测定 | 第45-47页 |
| 2.4.3 应用HeparinaseⅠ解聚heparin | 第47-48页 |
| 2.5 小结 | 第48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| 第三章 Heparinase Ⅲ的表达、纯化及应用 | 第50-64页 |
| 3.1 前言 | 第50-51页 |
| 3.2 实验材料 | 第51页 |
| 3.2.1 菌株 | 第51页 |
| 3.2.2 实验药品 | 第51页 |
| 3.2.3 培养基及缓冲液 | 第51页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-55页 |
| 3.3.1 Heparinase Ⅲ工程菌的诱导表达 | 第51-52页 |
| 3.3.2 Heparinase Ⅲ生产条件的优化 | 第52页 |
| 3.3.2.1 IPTG用量的优化 | 第52页 |
| 3.3.2.2 培养温度的优化 | 第52页 |
| 3.3.2.3 培养时间的优化 | 第52页 |
| 3.3.3 Heparinase Ⅲ的分离纯化 | 第52-53页 |
| 3.3.4 蛋白含量的测定 | 第53页 |
| 3.3.5 Heparinase Ⅲ的酶活检测 | 第53-54页 |
| 3.3.6 Heparinase Ⅲ解聚heparosan | 第54-55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-61页 |
| 3.4.1 工程菌Heparinase Ⅲ蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 3.4.2 Heparinase Ⅲ生产条件的优化 | 第56-60页 |
| 3.4.2.1 IPTG浓度对Heparinase Ⅲ产量的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.2.2 培养温度对Heparinase Ⅲ产量的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.2.3 培养时间对Heparinase Ⅲ产量的影响 | 第58-60页 |
| 3.4.3 Heparinase Ⅲ的分离纯化 | 第60-61页 |
| 3.4.4 应用Heparinase Ⅲ解聚heparosan | 第61页 |
| 3.5 小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-64页 |
| 第四章 应用Heparinase Ⅲ检测样本heparosan含量酶学方法的建立 | 第64-74页 |
| 4.1 前言 | 第64页 |
| 4.2 实验材料 | 第64-66页 |
| 4.2.1 实验药品 | 第64-65页 |
| 4.2.2 培养基及缓冲液 | 第65页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第65-66页 |
| 4.3 实验方法 | 第66-68页 |
| 4.3.1 检测体系Ⅰ的建立 | 第66-67页 |
| 4.3.1.1 Ⅰ的反应体系的确定 | 第66页 |
| 4.3.1.2 检测体系Ⅰ中酶量的确定 | 第66-67页 |
| 4.3.1.3 检测体系Ⅰ标准曲线的制作 | 第67页 |
| 4.3.1.4 应用检测体系Ⅰ与卡唑法对样本heparosan含量的检测比较 | 第67页 |
| 4.3.2 提高hepaerosan检测阈的酶检测体系Ⅱ的建立 | 第67-68页 |
| 4.3.2.1 Ⅱ的反应体系的确定 | 第67-68页 |
| 4.3.2.2 检测体系Ⅱ标准曲线的制作 | 第68页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第68-72页 |
| 4.4.1 检测体系Ⅰ的建立 | 第68-71页 |
| 4.4.1.1 检测体系Ⅰ中酶量的确定 | 第68-69页 |
| 4.4.1.2 检测体系Ⅰ标准曲线的制作 | 第69-70页 |
| 4.4.1.3 应用检测体系Ⅰ与卡唑法对样本heparosan含量的检测比较 | 第70-71页 |
| 4.4.2 检测体系Ⅱ的建立 | 第71-72页 |
| 4.5 小结 | 第72页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 第五章 E. coli K5 waaR基因的克隆及序列分析 | 第74-84页 |
| 5.1 前言 | 第74页 |
| 5.2 实验材料 | 第74-76页 |
| 5.2.1 菌株 | 第74页 |
| 5.2.2 试剂及工具酶 | 第74-75页 |
| 5.2.3 培养基及缓冲液 | 第75-76页 |
| 5.2.4 实验仪器 | 第76页 |
| 5.3 实验方法 | 第76-80页 |
| 5.3.1 E.coli K5基因组的提取 | 第76-77页 |
| 5.3.2 E coli K5 waaR的扩增 | 第77-79页 |
| 5.3.2.1 引物的设计 | 第77-78页 |
| 5.3.2.2 目的基因的扩增 | 第78-79页 |
| 5.3.3 PCR产物的检测及切胶回收 | 第79页 |
| 5.3.4 送样测序 | 第79-80页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第80-82页 |
| 5.4.1 基因组的提取及目的基因的扩增 | 第80页 |
| 5.4.2 测序结果与序列分析 | 第80-82页 |
| 5.5 小结 | 第82页 |
| 参考文献 | 第82-84页 |
| 第六章 E. coli K5 waaR基因的敲除 | 第84-102页 |
| 6.1 前言 | 第84-85页 |
| 6.2 实验材料 | 第85-87页 |
| 6.2.1 菌株与质粒 | 第85页 |
| 6.2.2 试剂及工具酶 | 第85页 |
| 6.2.3 培养基及缓冲液 | 第85-86页 |
| 6.2.4 实验仪器 | 第86页 |
| 6.2.5 实验所用引物 | 第86-87页 |
| 6.3 实验方法 | 第87-90页 |
| 6.3.1 质粒pKD46、pKD4的提取 | 第87-88页 |
| 6.3.2 pKD46电转化E.coli K5 | 第88页 |
| 6.3.3 E. coli K5/pKD46的鉴定 | 第88-89页 |
| 6.3.4 线性打靶waaR-kan-waaR片段的制备 | 第89页 |
| 6.3.5 E.coli K5/pKD46感受态细胞的制备 | 第89页 |
| 6.3.6 打靶DNA的电转化 | 第89-90页 |
| 6.3.7 重组菌株的鉴定 | 第90页 |
| 6.3.8 E. coli K5野生株和E. coli K5 waaR突变株电镜形态 | 第90页 |
| 6.4 实验结果 | 第90-99页 |
| 6.4.1 质粒pKD46,pKD4的提取 | 第90-91页 |
| 6.4.2 E.coli K5/pKD46菌株的获得 | 第91-92页 |
| 6.4.3 E. coli K5/pKD46的鉴定 | 第92-93页 |
| 6.4.4 打靶片段的制备 | 第93页 |
| 6.4.5 重组子的获得 | 第93-94页 |
| 6.4.6 转化子的验证 | 第94-98页 |
| 6.4.7 野生株和突变株电镜形态观察 | 第98-99页 |
| 6.5 小结 | 第99页 |
| 参考文献 | 第99-102页 |
| 第七章 结论与展望 | 第102-105页 |
| 7.1 结论 | 第102-103页 |
| 7.2 展望 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第106页 |
