| 摘要 | 第2-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述及研究背景 | 第14-28页 |
| 1.1 水稻基因组与功能基因组学研究基础 | 第14页 |
| 1.2 水稻突变体的获得 | 第14-15页 |
| 1.3 基因组编辑技术的发展及应用前景 | 第15-23页 |
| 1.3.1 锌指核酸酶(ZFN) | 第16-18页 |
| 1.3.2 类转录激活效应因子核酸酶(TALEN) | 第18-20页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9系统 | 第20-21页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9与ZFN和TALEN 比较 | 第21-23页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9系统在植物中的发展与应用 | 第23-26页 |
| 1.4.1 单基因、多基因敲除 | 第23页 |
| 1.4.2 靶位点的特异性和脱靶率 | 第23-24页 |
| 1.4.3 后代突变体的筛选 | 第24页 |
| 1.4.4 基因组编辑植物的生物安全性 | 第24-26页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第26-27页 |
| 1.6 本研究的技术路线 | 第27-28页 |
| 第2章 CRISPR/Cas9介导的水稻单基因敲除 | 第28-40页 |
| 2.1 前言 | 第28-31页 |
| 2.2 实验材料 | 第31-32页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第31页 |
| 2.2.2 菌株和载体 | 第31页 |
| 2.2.3 实验试剂 | 第31页 |
| 2.2.4 常用培养基及生化试剂配制 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-36页 |
| 2.3.1 单基因敲除的sgRNA设计与表达载体的组装 | 第32-34页 |
| 2.3.2 水稻DNA提取 | 第34-35页 |
| 2.3.3 转基因及转基因阳性株的获得 | 第35页 |
| 2.3.4 突变体的筛选与鉴定 | 第35-36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-39页 |
| 2.4.1 转基因阳性苗的获得 | 第36-37页 |
| 2.4.2 突变株突变类型分析 | 第37-39页 |
| 2.5 小结 | 第39-40页 |
| 第3章 CRISPR/Cas9介导的水稻多基因敲除系统的建立 | 第40-53页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第40页 |
| 3.2.2 菌株和载体 | 第40页 |
| 3.2.3 实验试剂 | 第40-41页 |
| 3.2.4 常用培养基及生化试剂配制 | 第41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-46页 |
| 3.3.1 多基因敲除的sgRNA的改造 | 第41页 |
| 3.3.2 多基因敲除的sgRNA设计与表达载体的组装 | 第41-44页 |
| 3.3.3 水稻DNA提取 | 第44页 |
| 3.3.4 转基因及转基因阳性株的获得 | 第44页 |
| 3.3.5 突变体的筛选与鉴定 | 第44-46页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第46-50页 |
| 3.4.1 转基因阳性株的获得 | 第46-47页 |
| 3.4.2 突变株突变类型分析 | 第47-50页 |
| 3.5 小结 | 第50-53页 |
| 第4章 CRISPR/Cas9介导的水稻8个基因共敲除 | 第53-72页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 实验材料 | 第53-54页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第53页 |
| 4.2.2 菌株和载体 | 第53-54页 |
| 4.2.3 实验试剂 | 第54页 |
| 4.2.4 常用培养基及生化试剂配制 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-62页 |
| 4.3.1 水稻8基因共敲除的靶位点设计 | 第54-55页 |
| 4.3.2 水稻8基因共敲除的sgRNA与表达载体组装 | 第55-59页 |
| 4.3.3 水稻原生质体转化 | 第59页 |
| 4.3.4 水稻DNA提取 | 第59页 |
| 4.3.5 转基因及转基因阳性株的获得 | 第59-60页 |
| 4.3.6 突变体的筛选与鉴定 | 第60页 |
| 4.3.7 田间主要农艺性状调查 | 第60-62页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第62-71页 |
| 4.4.1 水稻原生质体中基因的敲除效率 | 第62-63页 |
| 4.4.2 T_0代突变效率和突变类型分析 | 第63-66页 |
| 4.4.3 靶位点脱靶分析 | 第66页 |
| 4.4.4 T_0代突变株的表型鉴定和分析 | 第66-71页 |
| 4.5 小结 | 第71-72页 |
| 第5章 CRISPR/Cas9介导的水稻产量相关QTL编辑 | 第72-93页 |
| 5.1 前言 | 第72页 |
| 5.2 实验材料 | 第72-73页 |
| 5.2.1 植物材料 | 第72页 |
| 5.2.2 菌株和载体 | 第72-73页 |
| 5.2.3 实验试剂 | 第73页 |
| 5.2.4 常用培养基及生化试剂配制 | 第73页 |
| 5.3 实验方法 | 第73-78页 |
| 5.3.1 水稻产量QTLs靶位点设计 | 第73-74页 |
| 5.3.2 水稻产量QTLs敲除的sgRNA与表达载体组装 | 第74-76页 |
| 5.3.3 水稻DNA提取 | 第76页 |
| 5.3.4 转基因及转基因阳性株的获得 | 第76页 |
| 5.3.5 突变体的筛选与鉴定 | 第76-77页 |
| 5.3.6 T_1代无选择标记基因突变株的获得 | 第77页 |
| 5.3.7 田间主要农艺性状调查 | 第77页 |
| 5.3.8 水稻小区实验 | 第77-78页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第78-91页 |
| 5.4.1 转基因阳性株的获得 | 第78页 |
| 5.4.2 突变株突变类型分析 | 第78-80页 |
| 5.4.3 新基因型突变株的获得及其产量性状的研究 | 第80-91页 |
| 5.4.3.1 转基因T_1代水稻株系产量性状的调查 | 第80-90页 |
| 5.4.3.2 转基因T_1代无选择标记基因突变株的获得 | 第90页 |
| 5.4.3.3 基因T_2代农艺性状调查 | 第90-91页 |
| 5.5 小结 | 第91-93页 |
| 第6章 总结与展望 | 第93-95页 |
| 6.1 总结 | 第93-94页 |
| 6.2 CRISPR/Cas技术的展望 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-104页 |
| 附录 | 第104-127页 |
| 附录1 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收 | 第104页 |
| 附录2 质粒DNA的提取、酶切和连接 | 第104-105页 |
| 附录3 感受态细胞的制备及转化 | 第105-107页 |
| 3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第105-106页 |
| 3.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第106页 |
| 3.3 农杆菌感受态细胞的制备 | 第106页 |
| 3.4 农杆菌感受态细胞的转化 | 第106-107页 |
| 附录4 水稻DNA提取 | 第107页 |
| 附录5 水稻原生质体转化 | 第107-109页 |
| 附录6 gRNA和Cas9序列 | 第109-112页 |
| 附录7 转基因T_0代三个基因突变序列分析结果 | 第112-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第128-129页 |
