| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-27页 |
| 第一节 RNA干扰技术简介及其在甲壳动物研究中的应用 | 第13-18页 |
| 1 RNAi的简介 | 第13-17页 |
| ·RNAi的发现 | 第13页 |
| ·RNAi的作用机制及特点 | 第13-15页 |
| ·RNAi所需dsRNA或siRNA的合成原则 | 第15页 |
| ·RNAi的导入方法 | 第15-17页 |
| ·注射法 | 第16页 |
| ·饲喂法 | 第16页 |
| ·浸泡法 | 第16-17页 |
| ·组织培养法 | 第17页 |
| 2 RNAi在甲壳动物中的应用 | 第17-18页 |
| ·功能基因的研究 | 第17-18页 |
| ·抗病毒研究 | 第18页 |
| 3 RNAi前景展望 | 第18页 |
| 第二节 MIH基因和tra-2基因的研究概况 | 第18-24页 |
| 1 MIH基因研究概况 | 第18-23页 |
| ·MIH基因简介 | 第20-21页 |
| ·MIH基因的结构 | 第21页 |
| ·MIH基因的作用机理 | 第21-22页 |
| ·MIH基因的功能及研究方法 | 第22-23页 |
| 2 transformer 2(tra-2)基因研究概况 | 第23-24页 |
| 第三节 本研究的目的与意义 | 第24-27页 |
| 第二章 青虾RNAi方法的研究 | 第27-39页 |
| 1 实验材料 | 第27-28页 |
| ·实验用虾 | 第27页 |
| ·试剂和仪器 | 第27-28页 |
| 2 dsRNA的准备 | 第28-31页 |
| ·青虾总RNA的提取 | 第28页 |
| ·实验用品的预处理 | 第28页 |
| ·总RNA的提取 | 第28页 |
| ·总RNA的质量检测和浓度测定 | 第28页 |
| ·反转录 | 第28页 |
| ·制备dsRNA所用引物设计 | 第28-29页 |
| ·开放阅读框片段的扩增 | 第29-30页 |
| ·PCR产物的回收、测序 | 第30页 |
| ·dsRNA的合成 | 第30页 |
| ·dsRNA的纯化 | 第30-31页 |
| ·dsRNA的质量检测和浓度测定 | 第31页 |
| 3 实验方法 | 第31-32页 |
| ·注射部位筛选 | 第31页 |
| ·时间依赖性干扰试验 | 第31页 |
| ·不同剂量干扰试验 | 第31-32页 |
| 4 RNA提取及荧光定量PCR检测 | 第32-33页 |
| ·RNA的提取 | 第32页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第32页 |
| ·RT-PCR反应 | 第32-33页 |
| ·Real-time荧光定量PCR分析 | 第33页 |
| 5 数据处理 | 第33页 |
| 6 实验结果 | 第33-36页 |
| ·最适注射部位筛选结果 | 第33页 |
| ·时间依赖性干扰实验结果 | 第33-34页 |
| ·不同剂量干扰效果比较 | 第34-36页 |
| 7 讨论 | 第36-39页 |
| ·注射部位的选择分析 | 第36-37页 |
| ·不同注射剂量的干扰效果的分析 | 第37页 |
| ·不同剂量的干扰规律 | 第37-39页 |
| 第三章 RNAi技术在青虾蜕皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的应用 | 第39-65页 |
| 第一节 青虾MIH基因全长cDNA的克隆及序列分析 | 第39-51页 |
| 1 实验材料 | 第39页 |
| ·实验虾 | 第39页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第39页 |
| 2 实验方法 | 第39-43页 |
| ·青虾眼柄总RNA的提取及反转录 | 第39-40页 |
| ·青虾MIH cDNA基因扩增所用引物设计 | 第40页 |
| ·中间片段的扩增 | 第40-41页 |
| ·青虾MIH基因的3'RACE | 第41-42页 |
| ·3'端反转录 | 第41页 |
| ·3'端扩增 | 第41-42页 |
| ·青虾MIH基因的5'RACE | 第42-43页 |
| ·5'RACE cDNA模板的制备 | 第42页 |
| ·5'端扩增 | 第42-43页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第43页 |
| ·序列的测定及分析 | 第43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-49页 |
| ·青虾眼柄总RNA提取结果 | 第43-44页 |
| ·青虾MIH部分片段、3'端和5'端的分离 | 第44页 |
| ·青虾MIH基因全长cDNA序列结构特征 | 第44-46页 |
| ·同源性分析 | 第46-47页 |
| ·系统发育分析 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 第二节 青虾MIH基因的时空表达分析 | 第51-58页 |
| 1 实验材料 | 第51-52页 |
| ·实验虾 | 第51-52页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52页 |
| ·引物设计及检验 | 第52页 |
| ·组织RNA的提取 | 第52页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第52页 |
| ·RT-PCR反应及分析 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-55页 |
| ·青虾各样本总RNA的检测 | 第53页 |
| ·MnMIH基因在青虾胚胎发育期、幼体发育期和幼虾发育期的表达 | 第53页 |
| ·青虾MIH基因在成体不同组织中的表达 | 第53-54页 |
| ·MnMIH基因在青虾蜕皮周期中表达差异结果 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| ·不同发育时期表达差异 | 第55-56页 |
| ·成体不同组织表达差异 | 第56-57页 |
| ·蜕皮周期表达水平差异 | 第57-58页 |
| 第三节 利用RNAi技术对青虾MIH基因功能的研究 | 第58-65页 |
| 1 材料与方法 | 第58-59页 |
| ·实验虾 | 第58页 |
| ·dsRNA的制备 | 第58-59页 |
| ·体外dsRNA的注射 | 第59页 |
| ·RNA提取及检测所用试剂和材料 | 第59页 |
| ·RT-PCR反应和结果分析 | 第59页 |
| 2 结果 | 第59-62页 |
| ·一次性RNAi对基因表达量的影响 | 第59-60页 |
| ·连续性RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响 | 第60-62页 |
| 3 讨论 | 第62-65页 |
| ·RNAi对MIH表达量的影响 | 第62页 |
| ·RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响 | 第62-65页 |
| 全文结论 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-79页 |
| 附录 实验试剂及配置 | 第79-81页 |
| 致谢 | 第81-83页 |
| 已发表或已接收的论文 | 第83页 |
