| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表（Abbreviations） | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-24页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的简介 | 第12页 |
| ·微生物谷氨酰胺合成酶的结构与催化机理 | 第12-14页 |
| ·微生物谷氨酰胺合成酶的结构（GSⅠ） | 第12-13页 |
| ·微生物谷氨酰胺合成酶的催化机理 | 第13-14页 |
| ·微生物中谷氨酰胺合成酶调控 | 第14-15页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的分布与功能 | 第15-16页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的研究进展 | 第16-17页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的应用 | 第17-20页 |
| ·谷氨酰胺合成酶催化合成谷氨酰胺 | 第17-18页 |
| ·谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸 | 第18-19页 |
| ·谷氨酰胺合成酶在转基因植物中的应用 | 第19-20页 |
| ·蛋白质的定向进化与理性设计 | 第20-22页 |
| ·蛋白质的定向进化 | 第20-21页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第21-22页 |
| ·分子模拟与定点突变 | 第22-23页 |
| ·同源建模与分子对接 | 第22页 |
| ·定点突变 | 第22-23页 |
| ·本项目研究目的及意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-43页 |
| ·材料 | 第24-29页 |
| ·质粒与菌株 | 第24-25页 |
| ·试剂 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·实验相关溶液 | 第25-27页 |
| ·仪器设备 | 第27-28页 |
| ·PCR引物 | 第28-29页 |
| ·谷氨酰胺合成酶exiGS基因的获得方法 | 第29-34页 |
| ·谷氨酰胺合成酶菌株的筛选 | 第29页 |
| ·谷氨酰胺合成酶转移酶活性测定 | 第29页 |
| ·exiGS基因的克隆 | 第29-32页 |
| ·PCR产物纯化、回收与酶切 | 第32页 |
| ·快速抽提细菌的质粒DNA | 第32页 |
| ·碱裂解抽提细菌的质粒DNA | 第32-33页 |
| ·构建p GEX-6p-exiGS重组表达载体 | 第33页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第33-34页 |
| ·电转化 | 第34页 |
| ·检测阳性克隆子 | 第34页 |
| ·ExiGS的表达与纯化 | 第34-37页 |
| ·感受态的制备 | 第34页 |
| ·ExiGS的诱导表达 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的配制 | 第35-36页 |
| ·ExiGS对草铵膦的耐受性试验 | 第36页 |
| ·ExiGS蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第37页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的酶学性质 | 第37-39页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第37-38页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的最适反应温度 | 第38页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的最适pH | 第38页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的热稳定性 | 第38页 |
| ·谷氨酰胺合成酶的pH稳定性 | 第38页 |
| ·金属离子和不同化学试剂对谷氨酰胺合成酶的影响 | 第38页 |
| ·酶动力学性质的测定 | 第38-39页 |
| ·谷氨酰胺合成酶ExiGS的突变体的构建 | 第39-42页 |
| ·突变位点的设计 | 第39-40页 |
| ·定点突变引物的设计 | 第40-41页 |
| ·突变体的构建 | 第41页 |
| ·突变体菌株的表达与活性检测 | 第41-42页 |
| ·突变体的蛋白的纯化与浓度测定 | 第42页 |
| ·突变体的酶学性质测定 | 第42页 |
| ·野生型与突变体GS竞争性抑制常数Ki值的测定 | 第42页 |
| ·突变体蛋白的结构模拟与分析 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-69页 |
| ·高活性谷氨酰胺合成酶菌株的筛选 | 第43页 |
| ·exiGS基因的克隆 | 第43-47页 |
| ·Exiguobacterium sp. N10-1 基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·PCR扩增exiGS基因 | 第44页 |
| ·重组质粒p GEX-6p-exiGS的构建 | 第44-47页 |
| ·ExiGS对草铵膦的耐受性试验 | 第47页 |
| ·ExiGS蛋白的表达和纯化 | 第47-50页 |
| ·ExiGS的酶学性质分析 | 第50-54页 |
| ·L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线的绘制 | 第50页 |
| ·ExiGS的最适温度和热稳定性 | 第50-51页 |
| ·ExiGS的最适pH和pH稳定性 | 第51-52页 |
| ·金属离子与化合物对ExiGS活性的影响 | 第52-53页 |
| ·ExiGS的动力学常数测定 | 第53-54页 |
| ·Exi GS的定点突变 | 第54-66页 |
| ·突变位点的设计 | 第54-56页 |
| ·ExiGS突变体的构建 | 第56-59页 |
| ·突变体蛋白的表达与相对活性检测 | 第59-60页 |
| ·突变体E60A、R64G和E60A/R64G蛋白的纯化 | 第60页 |
| ·突变体酶学性质测定 | 第60-66页 |
| ·野生型和突变体GS竞争性抑制常数Ki值的测定 | 第66页 |
| ·突变体蛋白的结构模拟与分析 | 第66-69页 |
| 4 讨论与总结 | 第69-73页 |
| ·谷氨酰胺合成酶ExiGS酶学性质的研究 | 第69-71页 |
| ·谷氨酰胺合成酶ExiGS的定点突变与分析 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-89页 |
| 研究成果 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90页 |