农药检测用量热式酶传感器中酶标农药的研究

【摘要】：由于农药在食品或农产品中的残留而造成的安全事件时有发生,造成人员和财产的巨大损失,是各级政府和人民群众十分关心的社会热点问题。目前常用的电化学式或测光型检测农药残留的方法有局限性,它们易受电化学活性成分或光学物质的干扰,检测结果可能是假阳性。量热式传感器检测方法简单、通用性强,能克服以上缺陷,但又往往由于生化反应产生的热量小、灵敏度差,难以测量。要解决以上问题,必需寻找有效的方法对相关反应热量进行放大,从而提高检测结果的精确度。采用反应焓变值较大的酶标记农药,利用标记酶较大的反应热来增加整个酶抑制法检测体系的热量是提高量热法检测农残精确性的一个途径。本文用微量热仪研究了酶反应焓变值的精确测定方法,筛选确定了用于标记的酶及其反应体系,并使用碳二亚胺法制备了酶标记的甲胺磷农药,并以酶标农药对固定化鸡肝酯酶的抑制率和单位抑制率下的标记酶活力为指标对制备条件进行了优化。首先,以过氧化氢酶催化过氧化氢酶反应为例,系统地研究了量热法-光度法同步联用测定酶反应焓变值的方法。探讨了初速度法和稳定态法计算酶反应焓变值的差异。通过与理论值和文献报道值比较,稳定态法得到的过氧化氢酶催化过氧化氢的酶反应焓变值100.98KJ/mol,标准差1.81 KJ/mol,更为准确且重现性更好。这种同步联用的方法使用相同的酶促反应体系,同时利用酶促反应的光学和热学性质来测定酶促反应进程,减少了反应物或生成物的不稳定带来的误差。其次,采用该法测定了过氧化氢酶催化过硼酸钠、?-内酰胺酶催化青霉素G钠以及葡萄糖氧化酶催化葡萄糖等不同酶的催化反应焓变值,发现该法针对葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应焓变值的测定可能由于机械摩擦、溶液混合导致的非特异性吸放热等原因而无法得到准确结果。除了葡萄糖氧化酶催化的反应外,前两个反应的焓变值分别为108.98KJ/mol、90.67KJ/mol,标准差分别为5.87 KJ/mol、4.63 KJ/mol。根据标记酶的筛选标准和反应热较大原则,确定过氧化氢酶作为标记酶,选取过硼酸钠作为标记酶的底物。最后,采用碳二亚胺为交联剂制备过氧化氢酶标记的甲胺磷农药。以酶标农药对固定化鸡肝酯酶的抑制率和单位抑制率下的标记酶活力为指标优化了酶标农药的制备条件。其具体为:过氧化氢酶和甲胺磷的摩尔比为1:10;30℃下酶与交联剂(EDC:NHS)反应;酶与交联剂反应采用0.05M的MES缓冲液(pH6);交联剂(EDC:NHS)加入的浓度比为5mmol/L:5mmol/L;在制备酶标农药中,不调节pH值;酶衍生物与甲胺磷反应的温度20℃。
【关键词】：酶反应焓变值 标记酶 过氧化氢酶 甲胺磷农药 酶标农药
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TS207.53;TP212