| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-16页 |
| 第一部分:多嘧啶串结合蛋白在剪接中的作用 | 第16-97页 |
| 第1章 引言 | 第16-30页 |
| ·可变剪接介绍 | 第16-18页 |
| ·可变剪接研究方法 | 第18-24页 |
| ·PTB蛋白简介 | 第24-25页 |
| ·U2AF65结构及功能介绍 | 第25-30页 |
| 第2章 材料与方法 | 第30-58页 |
| ·材料 | 第30-39页 |
| ·菌株、细胞系以及所使用质粒 | 第30页 |
| ·主要生化试剂、溶液及其来源 | 第30-31页 |
| ·细胞操作使用试剂 | 第31页 |
| ·酶类 | 第31-32页 |
| ·同位素相关 | 第32页 |
| ·RNA合成 | 第32-33页 |
| ·本研究中所使用部分引物序列(更多序列见结果与讨论) | 第33页 |
| ·数据分析软件 | 第33页 |
| ·图像处理,绘图软件 | 第33页 |
| ·实验中使用到的主要仪器 | 第33-35页 |
| ·一些常用溶液的配制 | 第35-37页 |
| ·配制SDS-PAGE使用10%(W/V,G/ML)过硫酸铵(APS):(1 ML) | 第35页 |
| ·SDS上样缓冲液配方(10 ML) | 第35页 |
| ·10%SDS-PAGE胶的配制 | 第35-36页 |
| ·5×TRIS-GLYCINE电泳缓冲液的配制:(1 L) | 第36页 |
| ·蛋白转膜缓冲液配制 | 第36页 |
| ·10×TBS(500 ML)及TBST(1 L)配制 | 第36页 |
| ·10×PBS 缓冲液配制(1 L) | 第36页 |
| ·DMEM 细胞培养基配制 | 第36-37页 |
| ·10×TBE配制 | 第37页 |
| ·CLIP实验所用溶液的配制:(所用器皿需无RNA酶污染) | 第37-39页 |
| ·洗脱缓冲液(WASH BUFFER)(500 ML) | 第37页 |
| ·高盐洗脱缓冲液(HIGH—SALT WASH BUFFER) | 第37页 |
| ·1×多核苷酸激酶 缓冲液(1×PNK BUFFER)(500 ML) | 第37-38页 |
| ·1×PNK+EGTA 缓冲液(500 ML) | 第38页 |
| ·20×MOPS SDS 电泳缓冲液配制 | 第38页 |
| ·20×TRANSFER BUFFER (转膜缓冲液) | 第38页 |
| ·1×转膜缓冲液 | 第38页 |
| ·1×PK BUFFER (1×蛋白酶K缓冲液) | 第38页 |
| ·磷酸钠缓冲液(NA-PHOSPHATE,PH=8.0,0.1 M) | 第38-39页 |
| ·方法 | 第39-58页 |
| ·CLIP实验流程(见图八) | 第39-50页 |
| ·细胞培养与处理 | 第39-41页 |
| ·免疫共沉淀(IMMUNOPRECIPITATION,IP) | 第41-43页 |
| ·磁珠的处理及其与抗体的偶联 | 第41-42页 |
| ·紫外交联后的细胞裂解液制备 | 第42页 |
| ·免疫共沉淀 | 第42-43页 |
| ·RNA标签(RNA TAG,即与蛋白结合的RNA部分)片段化 | 第43-44页 |
| ·碱性磷酸酶处(CIP TREATMENT) | 第44页 |
| ·3’RNA接头(3’RNA LINKER/ADAPTER,RL3/RP3)的连接(磁珠上进行) | 第44页 |
| ·PNK处理,同位素标记RNA(在磁珠上进行) | 第44-45页 |
| ·SDS—PAGE和NC(NITROCELLIULOSE)膜转膜 | 第45-47页 |
| ·RNA提取以及纯化 | 第47页 |
| ·连接5’RNA接头 | 第47-48页 |
| ·RT-PCR | 第48-49页 |
| ·TA克隆和测序 | 第49-50页 |
| ·细胞培养 | 第50-51页 |
| ·细胞传代(以T25培养瓶为例,其他按培养面积调整体系) | 第50页 |
| ·细胞冻存 | 第50-51页 |
| ·细胞复苏 | 第51页 |
| ·细胞转染方法 | 第51-54页 |
| ·SIRNA及ESIRNA的制备及转染 | 第51-54页 |
| ·SIRNA及ESIRNA的制备 | 第51-53页 |
| ·SIRNA及ESIRNA的转染 | 第53-54页 |
| ·质粒转染方法 | 第54页 |
| ·RT-PCR | 第54-56页 |
| ·RNA提取 | 第54-55页 |
| ·反转录 | 第55页 |
| ·DNA酶Ⅰ(DNASEⅠ)处理 | 第55页 |
| ·RT(以一个反应体系为例) | 第55页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第55-56页 |
| ·免疫印迹(WESTERN/IMMUNOBLOT) | 第56-58页 |
| ·SDS—PAGE 以及转膜 | 第56页 |
| ·封闭以及抗体杂交 | 第56-57页 |
| ·显影 | 第57-58页 |
| 第3章 结果和讨论 | 第58-97页 |
| ·PTB CLIP-SEQ | 第58-67页 |
| ·PTB CLIP 最适 MNASE 浓度的探索 | 第58-63页 |
| ·PTB CLIP | 第63-65页 |
| ·PTB CLIP—SEQ 结果部分分析 | 第65-67页 |
| ·U2AF65 CLIP-SEQ | 第67-76页 |
| ·U2AF65 抗体 MC3 检测 | 第67-68页 |
| ·U2AF65 CLIP 最适 MICROCOCAL NUCLEASE (MNASE) 浓度的摸索 | 第68-70页 |
| ·U2AF65 CLIP | 第70-76页 |
| ·U2AF65 CLIP—SEQ 数据分析及部分实验验证 | 第76-96页 |
| ·高通量测序质量分析 | 第76-78页 |
| ·RIP-PCR 验证高通量测序结果 | 第78-79页 |
| ·U2AF65 结合位点的基因组分布 | 第79-83页 |
| ·U2AF65 结合的序列富含U | 第83-84页 |
| ·U2AF65 在前体MRNA剪接中的功能 | 第84-96页 |
| ·U2AF65 的结合位点高度富集在外显子-内含子节点 | 第84-85页 |
| ·U2AF65 在5’剪接位点的功能分析 | 第85-87页 |
| ·U2AF65 的结合位点富集在组成型内含子 PPT 区域并与 PTB 存在潜在竞争。 | 第87-88页 |
| ·U2AF65 在可变剪接调控中作用的统计学分析 | 第88-89页 |
| ·U2AF65 对可变剪接的调控的实验验证 | 第89-96页 |
| ·小规模检测 U2AF65 敲低后基因剪接变化 | 第89-95页 |
| ·基因组范围内研究 U2AF65 调控组成型剪接和可变剪接的功能 | 第95-96页 |
| ·工作展望 | 第96-97页 |
| 第二部分 在博士期间进行的其他工作 | 第97-106页 |
| 第1章 U1 SNRNP 识别5’剪接位点的探索 | 第97-103页 |
| ·背景介绍 | 第97-99页 |
| ·方法 | 第99页 |
| ·结果与讨论 | 第99-103页 |
| 第2章 大规模RNAI敲低RNA结合蛋白鉴定SMN剪接调控因子 | 第103-106页 |
| ·前言和方法 | 第103页 |
| ·结果 | 第103-106页 |
| 参考文献 | 第106-111页 |
| 研究生期间发表或待发表的论文 | 第111-112页 |
| 附录部分英文缩写释义 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113页 |
