| 目录 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-18页 |
| 第一部分 携带P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因的重组杆状病毒载体的构建及鉴定 | 第18-56页 |
| 一、实验材料与方法 | 第19-43页 |
| 1. 实验材料 | 第19-22页 |
| ·基因、质粒、菌株、Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统和细胞 | 第19-20页 |
| ·工具酶及试剂 | 第20-21页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| 2. 实验方法 | 第22-43页 |
| ·4AngⅡs基因的获得及保存 | 第22-24页 |
| ·4AngⅡs基因的获得 | 第23页 |
| ·4AngⅡs基因的保存 | 第23-24页 |
| ·重组质粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的构建及鉴定 | 第24-26页 |
| ·4AngⅡs基因片段的获得 | 第24-25页 |
| ·载体质粒pT7-18f基因片段的获得 | 第25页 |
| ·连接4AngⅡs基因片段和载体pT7-18f基因片段 | 第25-26页 |
| ·重组质粒pT7-18f-4AngⅡs的获得及鉴定 | 第26页 |
| ·重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定 | 第26-33页 |
| ·目的基因P1-2A-4AngⅡs和3ABC的克隆 | 第27-29页 |
| ·将P1-2A-4AngⅡs基因片段克隆至pFastbac-Dual质粒中 | 第29-31页 |
| ·将3ABC基因片段克隆至重组质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs中 | 第31-32页 |
| ·重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定 | 第33-37页 |
| ·制备E.coli DH10感受态细胞 | 第33-34页 |
| ·重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转化E.coli DH10 | 第34-35页 |
| ·重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的提取 | 第35页 |
| ·重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定 | 第35-37页 |
| ·Sf9细胞的培养 | 第37-38页 |
| ·Grace完全培养基的配制 | 第37页 |
| ·Sf9细胞传代培养 | 第37-38页 |
| ·Sf9细胞的培养条件 | 第38页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的包装和扩增 | 第38-39页 |
| ·重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转染sf9细胞 | 第38-39页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的收获及传代 | 第39页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鉴定 | 第39-42页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC基因组的提取 | 第39-40页 |
| ·PCR方法鉴定重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC | 第40-42页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC颗粒的形态学观察 | 第42页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度的测定 | 第42-43页 |
| 二、实验结果与分析 | 第43-53页 |
| 1. 重组质粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的构建及鉴定 | 第43-44页 |
| 2. 重组供体质粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定 | 第44-46页 |
| 3. 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的构建及鉴定 | 第46-48页 |
| 4. Bacmid-GFP转染sf9细胞后荧光生成情况 | 第48-49页 |
| 5. 重组杆粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC转染sf9细胞后的细胞形态变化情况 | 第49-50页 |
| 6. PCR验证重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC | 第50-51页 |
| 7. 透射电镜下观察重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC颗粒形态结构 | 第51-52页 |
| 8. 蚀斑实验测定重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度 | 第52-53页 |
| 三、讨论 | 第53-56页 |
| 第二部分 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表达、鉴定及免疫原性和治疗效果分析 | 第56-88页 |
| 一、实验材料和方法 | 第57-72页 |
| 1. 实验材料 | 第57-59页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC和细胞 | 第57页 |
| ·实验动物 | 第57-58页 |
| ·主要试剂 | 第58页 |
| ·主要仪器 | 第58-59页 |
| ·引物 | 第59页 |
| 2. 实验方法 | 第59-72页 |
| ·Sf9细胞的大规模培养 | 第59-61页 |
| ·Grace完全培养基的配制 | 第59页 |
| ·Sf9细胞的冻存 | 第59-60页 |
| ·Sf9细胞的复苏及传代培养 | 第60页 |
| ·Sf9细胞的培养条件 | 第60-61页 |
| ·Sf9细胞计数 | 第61页 |
| ·Sf9细胞活性测定 | 第61页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表达及鉴定 | 第61-66页 |
| ·重组杆状病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC感染sf9细胞 | 第61-62页 |
| ·RT-PCR | 第62-64页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs样品的制备和SDS-PAGE凝胶电泳 | 第64-65页 |
| ·Western blot | 第65页 |
| ·间接免疫荧光 | 第65-66页 |
| ·透射电镜下观察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP结构 | 第66页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件的摸索 | 第66-67页 |
| ·Western blot确定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件 | 第66-67页 |
| ·ELISA确定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表达条件 | 第67页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的纯化和鉴定 | 第67-69页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的大量制备及纯化 | 第68页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的鉴定 | 第68页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的浓度测定 | 第68-69页 |
| ·目的蛋白pHAV-4AngⅡs的免疫原性和治疗效果分析 | 第69-72页 |
| ·实验动物 | 第69页 |
| ·免疫方案 | 第69-70页 |
| ·血清的处理及保存 | 第70页 |
| ·血压的测量 | 第70-71页 |
| ·抗AngⅡ抗体滴度的测定 | 第71页 |
| ·血清中AngⅡ含量的测定 | 第71-72页 |
| ·对数据进行统计学分析 | 第72页 |
| 二、实验结果与分析 | 第72-85页 |
| 1. 细胞计数 | 第72页 |
| 2. 细胞病变 | 第72-73页 |
| 3. RT-PCR | 第73-74页 |
| 4. SDS-PAGE和Western blot | 第74-75页 |
| 5. 间接免疫荧光 | 第75页 |
| 6. 透射电镜下观察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP结构 | 第75-76页 |
| 7. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的最佳表达时间和MOI值 | 第76-77页 |
| 8. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的纯化和鉴定 | 第77-78页 |
| 9. 血压测定 | 第78-81页 |
| 10. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后抗体滴度的测定与分析 | 第81-82页 |
| 11. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后血清中抗原AngⅡ的浓度的测定与分析 | 第82-84页 |
| 12. 血压值、抗体滴度和AngⅡ水平之间的两两相关性分析 | 第84-85页 |
| ·血压值和抗体滴度相关性分析 | 第84页 |
| ·血压值和AngⅡ水平相关性分析 | 第84-85页 |
| ·抗体滴度和AngⅡ水平相关性分析 | 第85页 |
| 三、讨论 | 第85-88页 |
| 小结 | 第88-89页 |
| 展望 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-95页 |
| 附录 | 第95-106页 |
| 论文综述 | 第106-119页 |
| 参考文献 | 第115-119页 |
| 致谢 | 第119-121页 |
| 研究生简历 | 第121-123页 |
