| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 目录 | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 前言 | 第11-17页 |
| 一、溶菌酶简介 | 第11-13页 |
| 二、胞内菌及其逃逸机制简介 | 第13-14页 |
| 三、甘露糖受体(mannose receptor,MR)简介 | 第14-15页 |
| 四、毕赤酵母表达系统简介 | 第15-17页 |
| 第一部分 人溶菌酶突变体的表达纯化及鉴定 | 第17-44页 |
| ·实验材料 | 第17-22页 |
| ·菌株、质粒、细胞 | 第17-18页 |
| ·限制性内切酶、工具酶、核酸及蛋白分子量标准 | 第18页 |
| ·试剂盒 | 第18页 |
| ·主要培养基 | 第18-19页 |
| ·主要溶液 | 第19-21页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-33页 |
| ·引物设计 | 第22页 |
| ·HepG2(人肝癌细胞株)总RNA的提取及第一链cDNA的反转录 | 第22-23页 |
| ·目的基因的拼接 | 第23-26页 |
| ·pPICZαA-hLYZ-myc-His载体构建 | 第26-29页 |
| ·重组菌GS115/pPICZαA-hLYZ-myc-His的构建 | 第29-30页 |
| ·重组菌的诱导表达及重组蛋白的纯化 | 第30-32页 |
| ·重组蛋白的鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白PNGaseF的糖型分析 | 第33页 |
| ·重组蛋白甘露糖化ConA检测 | 第33页 |
| ·实验结果 | 第33-43页 |
| ·人溶菌酶基因的钓取 | 第33-35页 |
| ·pPICZαA/hLYZ-myc-His载体构建 | 第35-38页 |
| ·重组酵母基因组中整合目的基因PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组蛋白TCA沉淀的SDS-PAGE分析 | 第39页 |
| ·重组蛋白Sephadex-G25柱脱盐及镍亲和层析纯化 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白肽指纹图谱鉴定 | 第40-42页 |
| ·重组蛋白Western印迹鉴定 | 第42页 |
| ·重组蛋白的PNGaseF的糖型分析 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白甘露糖化ConA检测 | 第43页 |
| ·小结 | 第43-44页 |
| 第二部分 hLYZ/eGFP的表达纯化及靶向定位 | 第44-53页 |
| ·实验材料 | 第44-46页 |
| ·菌株、质粒、细胞 | 第44-45页 |
| ·工具酶、抗体及分子量标准 | 第45页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第45页 |
| ·主要仪器及配件 | 第45页 |
| ·主要培养液和溶液 | 第45-46页 |
| ·实验方法 | 第46-48页 |
| ·pPICZaA-hLYZ/eGFP载体构建 | 第46-47页 |
| ·目的基因的转化 | 第47页 |
| ·酵母基因组鉴定 | 第47页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第47页 |
| ·融合蛋白的纯化及浓缩 | 第47-48页 |
| ·融合蛋白糖基化分析 | 第48页 |
| ·细胞培养 | 第48页 |
| ·融合蛋白在巨噬细胞RAW264.7中的荧光检测 | 第48页 |
| ·实验结果 | 第48-51页 |
| ·hLYZ、eGFP基因的克隆及质粒pPICZαA-hLYZ/eGFP的构建 | 第48-49页 |
| ·重组酵母工程菌目的基因的鉴定及蛋白表达 | 第49-50页 |
| ·融合蛋白的纯化及糖基化分析 | 第50页 |
| ·融合蛋白在巨噬细胞Raw264.7中的定位 | 第50-51页 |
| ·实验小结 | 第51-53页 |
| 第三部分 低甘露糖化hLYZ表达纯化及活性鉴定 | 第53-79页 |
| ·实验材料 | 第53-54页 |
| ·菌株、质粒、细胞 | 第53-54页 |
| ·限制性内切酶、工具酶、核酸及蛋白分子量标准 | 第54页 |
| ·试剂盒、培养基、溶液、抗体 | 第54页 |
| ·主要仪器及配件 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-63页 |
| ·引物设计 | 第54-55页 |
| ·pPICZαA-hLYZ载体及pPICZαA-hLYZ(N/Q)载体的构建 | 第55-59页 |
| ·重组菌的构建 | 第59-60页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及分离纯化 | 第60-61页 |
| ·毕赤酵母表达重组蛋白甘露糖化修饰的检测 | 第61-62页 |
| ·重组蛋白Western印迹鉴定 | 第62页 |
| ·重组蛋白PNGaseF的糖型分析 | 第62页 |
| ·重组蛋白抑菌活性的鉴定 | 第62页 |
| ·不同糖基化修饰重组hLYZA体外抑菌活性活性的比较 | 第62-63页 |
| ·低糖基化菌GJK05表达重组hLYZ的细胞免疫荧光实验 | 第63页 |
| ·实验结果 | 第63-78页 |
| ·pPICZαA-hLYZ载体构建 | 第63-66页 |
| ·pPICZαA-hLYZ(N/Q)载体的构建 | 第66-68页 |
| ·线化质粒整合酵母基因组的PCR鉴定 | 第68-70页 |
| ·重组蛋白的表达分离纯化 | 第70-72页 |
| ·毕赤酵母表达重组蛋白甘露糖化修饰的检测 | 第72-73页 |
| ·低甘露糖化重组hLYZ肽指纹图谱鉴定 | 第73-74页 |
| ·重组蛋白Western印迹鉴定 | 第74-75页 |
| ·低甘露糖化重组hLYZ PNGaseF酶切的N-糖型分析 | 第75页 |
| ·重组hLYZ抑菌活性的鉴定 | 第75-76页 |
| ·不同糖基化修饰hLYZA体外抑菌活性活性的比较 | 第76-77页 |
| ·低糖基化菌GJK05表达重组hLYZ的细胞免疫荧光实验 | 第77-78页 |
| ·小结 | 第78-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 讨论 | 第80-83页 |
| 参考文献 | 第83-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第88页 |
