| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-45页 |
| 0 致病性大肠杆菌概况 | 第16页 |
| 1 水平基因转移介导致病型大肠杆菌产生 | 第16-19页 |
| 2 细菌水平基因转移与CRISPR进化 | 第19-27页 |
| 2.1 CRISPR-Cas的结构和类型 | 第19-21页 |
| 2.2 前间隔序列邻近基序的靶向识别 | 第21-22页 |
| 2.3 CRISPR RNAs转录 | 第22页 |
| 2.4 Cas蛋白发挥关键作用 | 第22-23页 |
| 2.5 CRISPR-Cas系统的分类 | 第23-27页 |
| 3 CRISPR-CAS系统作用机制 | 第27-34页 |
| 3.1 新间隔序列spacer的获取 | 第29-31页 |
| 3.2 CRISPR RNAs的表达加工 | 第31-32页 |
| 3.3 CRISPR-Cas实现对外源DNA干扰 | 第32-33页 |
| 3.4 CRISPR-Cas功能调节 | 第33-34页 |
| 4 CRISPR-CAS系统应用 | 第34-43页 |
| 4.1 细菌分型及流行病学分析 | 第34-37页 |
| 4.2 针对噬菌体和质粒的防御作用 | 第37-38页 |
| 4.3 噬菌体促使细菌CRISPR位点高度变异 | 第38-39页 |
| 4.4 CRISPR-Cas系统除免疫之外的其他功能 | 第39-41页 |
| 4.5 噬菌体针对CRISPR-Cas系统的逃逸机制 | 第41-42页 |
| 4.6 CRISPR-Cas9基因编辑技术 | 第42-43页 |
| 5 展望 | 第43-44页 |
| 6 本论文的研究目的及意义 | 第44-45页 |
| 第二章 大肠杆菌CRISPR-CAS序列多样性及分类应用 | 第45-76页 |
| 一、大肠杆菌代表菌株CRISPR序列分析 | 第45-56页 |
| 1 试剂与材料 | 第45-46页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第45页 |
| 1.2 主要试剂与仪器 | 第45-46页 |
| 2 实验方法 | 第46-48页 |
| 2.1 大肠杆菌菌株CRISPR序列分析 | 第46-48页 |
| 3 结果 | 第48-54页 |
| 3.1 大肠杆菌菌株CRISPR的PCR扩增及序列分析 | 第48-54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 二、禽源大肠杆菌CRISPR序列多样性分析及分类应用 | 第56-76页 |
| 1 材料和试剂 | 第56-57页 |
| 1.1 菌株 | 第56页 |
| 1.2 主要试剂与仪器 | 第56-57页 |
| 2 实验方法 | 第57-59页 |
| 2.1 细菌DNA提取 | 第57页 |
| 2.2 CRISPR序列扩增引物 | 第57-58页 |
| 2.3 APEC和AFEC菌株CRISPR序列扩增 | 第58页 |
| 2.4 目的片段连接反应 | 第58页 |
| 2.5 阳性克隆鉴定及测序 | 第58-59页 |
| 3 结果 | 第59-74页 |
| 3.1 APEC和AFEC菌株CRISPR序列扩增 | 第59-60页 |
| 3.2 APEC和AFEC菌株CRISPR序列分析 | 第60-71页 |
| 3.3 APEC和AFEC菌株CRISPR多样性 | 第71-74页 |
| 4 讨论 | 第74-76页 |
| 第三章 大肠杆菌CRISPR-CAS系统与噬菌体感染的互作关系研究 | 第76-93页 |
| 1 材料和试剂 | 第77页 |
| 1.1 菌株及质粒 | 第77页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第77页 |
| 2 实验方法 | 第77-86页 |
| 2.1 ΦMin27噬菌体诱导 | 第77页 |
| 2.2 ΦMin27噬菌体效价检测 | 第77-78页 |
| 2.3 ΦMin27溶原感染模型建立 | 第78页 |
| 2.4 E.coli K-12 CRISPR功能分析 | 第78-86页 |
| 3 结果 | 第86-91页 |
| 3.1 ΦMin27溶原感染模型建立 | 第86页 |
| 3.2 E.coli K-12 H-NS、CRISPR1和CRISPR2缺失株构建 | 第86-87页 |
| 3.3 E.coli K-12 H-NS、CRISPR1和CRISPR2缺失株生长特性 | 第87-88页 |
| 3.4 缺失株cas基因转录水平 | 第88页 |
| 3.5 hns基因缺失株对外源质粒转化的抵抗力 | 第88-90页 |
| 3.6 缺失株对ΦMin27噬菌体溶原感染的抵抗力 | 第90页 |
| 3.7 缺失株对ΦMin27噬菌体裂解感染的抵抗力 | 第90-91页 |
| 3.8 hns基因缺失株CRISPR间隔序列变化 | 第91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| 第四章 H-NS突变介导的大肠杆菌CRISPR-Cas激活对Stx2噬菌体溶原的影响 | 第93-113页 |
| 1 材料和试剂 | 第95-97页 |
| 1.1 菌株及质粒 | 第95-96页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第96-97页 |
| 2 实验方法 | 第97-104页 |
| 2.1 hns缺失状态下Min27噬菌体溶原株构建 | 第97页 |
| 2.2 hns基因缺失溶原株株生物学特性 | 第97-98页 |
| 2.3 重组噬菌体ФMin27(Δstx::cat)构建 | 第98-100页 |
| 2.4 ΦMin27来源spacer的重组CRISPR质粒构建 | 第100-102页 |
| 2.5 ΦMin27噬菌体裂解和溶原感染效率 | 第102页 |
| 2.6 携带重组CRISPR质粒的溶原菌株噬菌体释放及毒素表达 | 第102-104页 |
| 3 结果 | 第104-111页 |
| 3.1 hns基因缺失溶原株生物学特性 | 第104-105页 |
| 3.2 重组噬菌体ФMin27(Δstx::cat)构建及其生物学特性 | 第105-106页 |
| 3.3 H-NS缺失介导激活的CRISPR-Cas抑制噬菌体复制 | 第106-107页 |
| 3.4 H-NS缺失介导激活的CRISPR-Cas抑制噬菌体溶原感染 | 第107-108页 |
| 3.5 激活的CRISPR-Cas抑制溶原株噬菌体释放 | 第108-109页 |
| 3.6 激活的CRISPR-Cas抑制溶原株志贺毒素表达 | 第109-111页 |
| 4 讨论 | 第111-113页 |
| 第五章 大肠杆菌CRISPR-Cas激活对T1样噬菌体裂解感染的影响 | 第113-144页 |
| 1 材料和试剂 | 第115-116页 |
| 1.1 材料及菌株 | 第115页 |
| 1.2 主要试剂和仪器 | 第115-116页 |
| 2 实验方法 | 第116-122页 |
| 2.1 噬菌体的分离与鉴定 | 第116页 |
| 2.2 噬菌体的富集及纯化 | 第116页 |
| 2.3 噬菌体电镜观察 | 第116页 |
| 2.4 噬菌体核酸类型鉴定 | 第116页 |
| 2.5 噬菌体的生物学特性分析 | 第116-117页 |
| 2.6 噬菌体全基因组测序 | 第117页 |
| 2.7 噬菌体全基因组序列分析 | 第117-118页 |
| 2.8 T1样噬菌体vB_EcoS_SH2效价测定 | 第118页 |
| 2.9 vB_EcoS_SH2噬菌体来源spacer的重组CRISPR质粒构建 | 第118-120页 |
| 2.10 携带重组CRISPR质粒的 Δhns缺失株构建 | 第120页 |
| 2.11 vB_EcoS_SH2感染携带重组CRISPR质粒菌株效率 | 第120页 |
| 2.12 携带重组CRISPR质粒菌株在vB_EcoS_SH2感染后存活情况 | 第120-121页 |
| 2.13 噬菌体感染后菌株质粒丢失情况 | 第121页 |
| 2.14 不同细菌密度条件下对vB_EcoS_SH2感染的抵抗能力 | 第121-122页 |
| 3 结果 | 第122-142页 |
| 3.1 大肠杆菌噬菌体的分离鉴定 | 第122-124页 |
| 3.2 大肠杆菌噬菌体的生物学特性 | 第124-127页 |
| 3.3 大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_SH2基因组序列分析 | 第127-137页 |
| 3.4 vB_EcoS_SH2感染携带重组CRISPR质粒菌株效率 | 第137-138页 |
| 3.5 携带重组CRISPR质粒菌株在vB_EcoS_SH2感染后存活情况 | 第138-139页 |
| 3.6 噬菌体感染后菌株质粒丢失情况 | 第139-140页 |
| 3.7 不同细菌密度条件下对vB_EcoS_SH2感染的抵抗能力 | 第140-142页 |
| 4 讨论 | 第142-144页 |
| 第六章 大肠杆菌CRISPR-CAS与STX2噬菌体双重溶原的相互作用关系 | 第144-164页 |
| 1 材料和试剂 | 第145-146页 |
| 1.1 菌株及质粒 | 第145页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第145-146页 |
| 2 实验方法 | 第146-151页 |
| 2.1 ΦMin27噬菌体双重溶原株构建 | 第146页 |
| 2.2 ΦMin27噬菌体双重溶原株验证 | 第146-147页 |
| 2.3 溶原株噬菌体整合位点分析 | 第147页 |
| 2.4 双重溶原株cas基因转录水平检测 | 第147-148页 |
| 2.5 双重溶原株与单一溶原株噬菌体诱导差异分析 | 第148页 |
| 2.6 携带重组CRISPR质粒的双重溶原株构建 | 第148页 |
| 2.7 携带重组CRISPR质粒的双重溶原株生物学特性 | 第148-149页 |
| 2.8 双重溶原株溶原裂解相关调控基因转录水平动态变化 | 第149页 |
| 2.9 Cas3蛋白功能分析 | 第149-151页 |
| 3 结果 | 第151-161页 |
| 3.1 ΦMin27噬菌体双重溶原株构建及鉴定 | 第151-152页 |
| 3.2 溶原株噬菌体整合位点分析 | 第152-153页 |
| 3.3 双重溶原株cas基因转录水平 | 第153页 |
| 3.4 双重溶原株与单一溶原株噬菌体释放差异 | 第153-154页 |
| 3.5 携带重组CRISPR质粒的双重溶原株噬菌体释放 | 第154-155页 |
| 3.6 双重溶原株毒素表达水平 | 第155页 |
| 3.7 噬菌体溶原株溶原裂解相关调控基因转录水平动态变化 | 第155-157页 |
| 3.8 Cas3蛋白过表达质粒构建及Cas3蛋白缺失株构建 | 第157-158页 |
| 3.9 Cas3过表达及缺失对CRISPR-Cas靶向的ΦMin27噬菌体溶原株的影响 | 第158-161页 |
| 4 讨论 | 第161-164页 |
| 全文总结 | 第164-165页 |
| 参考文献 | 第165-176页 |
| 论文发表情况 | 第176-177页 |
| 致谢 | 第177-179页 |
