| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 海洋微生物 | 第14-16页 |
| 1.1.1 海洋微生物的主要特性 | 第14-15页 |
| 1.1.2 海洋微生物中氧化还原酶的研究 | 第15-16页 |
| 1.2 苹果酸脱氢酶 | 第16-20页 |
| 1.2.1 苹果酸脱氢酶的性质 | 第19-20页 |
| 1.2.2 苹果酸脱氢酶的用途 | 第20页 |
| 1.3 高密度发酵 | 第20-25页 |
| 1.3.1 高密度发酵的影响因素 | 第21-22页 |
| 1.3.2 补料策略 | 第22-23页 |
| 1.3.3 发酵方式 | 第23-25页 |
| 1.4 本课题研究目的及意义 | 第25-26页 |
| 第二章 产苹果酸脱氢酶菌株筛选及重组表达菌株的构建 | 第26-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-31页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第26-27页 |
| 2.1.2 主要实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 主要分子操作试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.4 溶液、缓冲液的配制 | 第29-30页 |
| 2.1.5 培养基的配制 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-40页 |
| 2.2.1 海洋菌株的培养 | 第31页 |
| 2.2.2 粗酶液的制备 | 第31页 |
| 2.2.3 酶活性测定 | 第31-32页 |
| 2.2.4 引物设计 | 第32-33页 |
| 2.2.5 苹果酸脱氢酶基因的克隆 | 第33-35页 |
| 2.2.6 重组质粒载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.7 重组大肠杆菌的构建 | 第37-40页 |
| 2.3 实验结果 | 第40-49页 |
| 2.3.1 目标菌株的筛选 | 第40-41页 |
| 2.3.2 温度梯度PCR | 第41-42页 |
| 2.3.3 目的基因MDH片段的克隆 | 第42页 |
| 2.3.4 NdeI和XhoI双酶切及质粒连接 | 第42-43页 |
| 2.3.5 重组大肠杆菌pET28a-MDH-BL21构建 | 第43-44页 |
| 2.3.6 测序结果 | 第44-45页 |
| 2.3.7 MDH基因及其编码蛋白的生物信息学分析 | 第45-48页 |
| 2.3.8 重组大肠杆菌pET28a-MDH-Rosetta构建 | 第48-49页 |
| 2.4 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 苹果酸脱氢酶的纯化及酶学性质的研究 | 第50-68页 |
| 3.1 实验材料 | 第50页 |
| 3.1.1 菌株 | 第50页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 | 第50页 |
| 3.2 实验方法 | 第50-56页 |
| 3.2.1 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第50页 |
| 3.2.2 菌体的收集及粗酶液的制备 | 第50-51页 |
| 3.2.3 酶活的测定 | 第51页 |
| 3.2.4 MDH的纯化 | 第51页 |
| 3.2.5 MDH的脱盐 | 第51-52页 |
| 3.2.6 蛋白质含量测定 | 第52-53页 |
| 3.2.7 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳 | 第53-54页 |
| 3.2.8 MDH最适温度和温度的稳定性的测定 | 第54-55页 |
| 3.2.9 MDH最适pH及pH稳定性的测定 | 第55-56页 |
| 3.3 实验结果 | 第56-67页 |
| 3.3.1 重组菌株中MDH酶活比较 | 第56-57页 |
| 3.3.2 MDH分离纯化 | 第57-59页 |
| 3.3.3 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳图 | 第59-60页 |
| 3.3.4 IPTG浓度优化 | 第60-61页 |
| 3.3.5 IPTG诱导时间的优化 | 第61-62页 |
| 3.3.6 最适温度及温度稳定性 | 第62-64页 |
| 3.3.7 酶的最适pH及pH稳定性 | 第64-66页 |
| 3.3.8 金属离子对MDH活性的影响 | 第66-67页 |
| 3.4 小结 | 第67-68页 |
| 第四章 高密度发酵 | 第68-85页 |
| 4.1 实验材料和方法 | 第68-70页 |
| 4.1.1 菌种 | 第68页 |
| 4.1.2 实验试剂和试验仪器 | 第68-69页 |
| 4.1.3 培养基 | 第69-70页 |
| 4.1.4 实验方法 | 第70页 |
| 4.2 Plackett-Burman实验 | 第70-75页 |
| 4.3 均匀设计优化培养基 | 第75-79页 |
| 4.4 5L发酵罐发酵 | 第79-85页 |
| 4.4.1 培养基 | 第79页 |
| 4.4.2 酶活的测定 | 第79页 |
| 4.4.3 生物量的测定 | 第79-80页 |
| 4.4.4 多阶段调控高密度发酵 | 第80-81页 |
| 4.4.5 结果与讨论 | 第81-85页 |
| 第五章 总结与展望 | 第85-87页 |
| 5.1 总结 | 第85-86页 |
| 5.2 展望 | 第86-87页 |
| 附录1 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
