| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-27页 |
| 1 转录组概述 | 第14-15页 |
| 2 鱼类性别决定与分化概述 | 第15-16页 |
| 3 母源因子及母源合子转换(MZT)概述 | 第16-19页 |
| 3.1 母源因子概述 | 第16-17页 |
| 3.2 获得母源突变体的方法 | 第17-18页 |
| 3.3 母源-合子转换(MZT) | 第18-19页 |
| 4 PCNA结合蛋白概述 | 第19-22页 |
| 4.1 PCNA概述 | 第19-20页 |
| 4.2 PCNA与蛋白的相互作用 | 第20-21页 |
| 4.3 PCNA相关因子P15~(PAF)概述 | 第21-22页 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与胚胎发育 | 第22-23页 |
| 5.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 | 第22-23页 |
| 5.2 Wnt/β-catenin信号通路调节斑马鱼胚胎发育 | 第23页 |
| 6 基因编辑技术 | 第23-25页 |
| 7 实验动物研究背景 | 第25-26页 |
| 7.1 黄颡鱼研究背景 | 第25页 |
| 7.2 斑马鱼研究背景 | 第25-26页 |
| 8 研究目的和意义 | 第26-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-48页 |
| 1 实验用鱼和细胞 | 第27页 |
| 2 所用载体和菌株 | 第27页 |
| 3 黄颡鱼性别鉴定 | 第27-28页 |
| 4 基因组DNA提取 | 第28页 |
| 5 总RNA提取 | 第28-29页 |
| 6 逆转录总RNA | 第29-30页 |
| 7 荧光定量PCR | 第30-32页 |
| 8 黄颡鱼454转录组测序 | 第32-34页 |
| 8.1 样品准备 | 第32页 |
| 8.2 454高通量测序 | 第32-33页 |
| 8.3 序列拼接与注释 | 第33页 |
| 8.4 SSRs、SNPs和INDELs标记的鉴定 | 第33-34页 |
| 9 DNA纯化回收 | 第34-35页 |
| 9.1 条带单一的PCR产物纯化 | 第34页 |
| 9.2 条带不单一的PCR产物纯化 | 第34-35页 |
| 10 胚胎整体原位杂交 | 第35-37页 |
| 10.1 RNA探针设计 | 第35页 |
| 10.2 RNA探针标记 | 第35-36页 |
| 10.3 杂交 | 第36-37页 |
| 11 斑马鱼p15~(PAF)基因CRISPR/Cas9敲除系统构建 | 第37-40页 |
| 11.1 基因序列的获取 | 第37-38页 |
| 11.2 p15~(PAF)基因CRISPR/Cas9靶位点设计 | 第38页 |
| 11.3 体外转录合成gRNA | 第38-39页 |
| 11.4 体外转录合成Cas9mRNA | 第39-40页 |
| 12 显微注射及死亡率、畸形率统计 | 第40页 |
| 13 CRISPR/Cas9斑马鱼敲除系统构建及检测 | 第40-41页 |
| 14 斑马鱼p15~(PAF)突变体转录组分析 | 第41-42页 |
| 14.1 样品准备 | 第41页 |
| 14.2 建库测序流程 | 第41页 |
| 14.3 转录组生物信息分析 | 第41-42页 |
| 15 蛋白质分析 | 第42-44页 |
| 15.1 斑马鱼胚胎蛋白样品制备 | 第42-43页 |
| 15.2 免疫共沉淀 | 第43-44页 |
| 15.3 Western blot分析 | 第44页 |
| 16 体外转录合成过表达mRNA和挽救实验 | 第44-45页 |
| 17 细胞培养 | 第45-47页 |
| 17.1 细胞培养与传代 | 第45页 |
| 17.2 细胞冻存与保藏 | 第45-46页 |
| 17.3 冻存细胞的复苏 | 第46页 |
| 17.4 细胞转染 | 第46页 |
| 17.5 亚细胞定位 | 第46-47页 |
| 18 斑马鱼胚胎荧光素酶活性分析 | 第47-48页 |
| 第三章 结果 | 第48-80页 |
| 1 黄颡鱼的转录组分析 | 第48-60页 |
| 1.1 黄颡鱼转录组的测序与拼接 | 第48-51页 |
| 1.2 有关生殖与性别决定分化的基因注释及信号通路鉴定 | 第51-54页 |
| 1.2.1 Unigene BLASTX比对功能注释 | 第51页 |
| 1.2.2 Unigene GO富集分析 | 第51-52页 |
| 1.2.3 Unigene COG富集分析 | 第52-54页 |
| 1.2.4 Unigene KEGG富集分析 | 第54页 |
| 1.3 性别决定和性别分化相关基因的鉴定与表达情况 | 第54-56页 |
| 1.4 SSRs、SNPs和INDELs的鉴定 | 第56-58页 |
| 1.5 p15~(PAF)基因在黄颡鱼性腺中的表达情况 | 第58-60页 |
| 2 母源p15~(PAF)基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能研究 | 第60-80页 |
| 2.1 p15~(PAF)在斑马鱼中的组织表达特征分析 | 第60页 |
| 2.2 p15~(PAF)在斑马鱼胚胎中的时空表达模式 | 第60-62页 |
| 2.3 斑马鱼p15~(PAF)突变体的构建 | 第62-65页 |
| 2.4 母源p15~(PAF)的缺失导致早期胚胎发育缺陷 | 第65-67页 |
| 2.5 p15~(PAF)影响母源因子的降解和合子基因的合成 | 第67-73页 |
| 2.5.1 对MZT过程中的WT和p15~(PAF)-M胚胎进行转录组测序分析 | 第67-68页 |
| 2.5.2 p15~(PAF)-M胚胎MZT进程受到影响 | 第68-70页 |
| 2.5.3 利用qRT-PCR验证典型母源基因与合子基因的表达 | 第70-71页 |
| 2.5.4 KEGG富集分析表明Wnt/β-catenin信号通路在p15~(PAF)-M胚胎中受到显著影响 | 第71-73页 |
| 2.6 β-catenin mRNA的过表达部分挽救p15~(PAF)母源缺失造成的胚胎缺陷 | 第73-76页 |
| 2.6.1 β-catenin mRNA的过表达部分挽救p15~(PAF)-M胚胎的表型 | 第73-75页 |
| 2.6.2 β-catenin mRNA的过表达部分挽救p15~(PAF)-M胚胎腹背轴分化缺陷 | 第75-76页 |
| 2.7 斑马鱼P15~(PAF)蛋白与β-catenin蛋白相互结合 | 第76-80页 |
| 2.7.1 p15~(PAF)和β-catenin协同作用于下游基因及调控胚胎发育 | 第76-78页 |
| 2.7.2 斑马鱼P15~(PAF)与β-catenin蛋白之间相互结合 | 第78-80页 |
| 第四章 讨论 | 第80-85页 |
| 1 通过黄颡鱼转录组测序获取大量基因信息并筛选性别分化相关基因 | 第80-82页 |
| 2 P15~(PAF)与β-catenin相互结合在斑马鱼早期胚胎发育中发挥重要作用 | 第82-85页 |
| 参考文献 | 第85-103页 |
| 附录 | 第103-106页 |
| 附录1 实验所用仪器 | 第103-104页 |
| 附录2 实验所用试剂 | 第104-105页 |
| 附录3 发表论文 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-108页 |
