| 摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第一章 前言 | 第16-50页 |
| 1 纤维蛋白溶解酶 | 第16-21页 |
| 1.1 纤溶酶在心血管疾病预防与治疗中的作用 | 第16-20页 |
| 1.2 产纤溶酶的微生物 | 第20-21页 |
| 2 蛋白酶 | 第21-30页 |
| 2.1 蛋白酶的分类 | 第22-25页 |
| 2.2 丝氨酸蛋白酶 | 第25-28页 |
| 2.3 枯草杆菌蛋白酶家族 | 第28-30页 |
| 3 蛋白酶前体及酶原的加工与成熟 | 第30-37页 |
| 3.1 前肽(propeptide)的作用 | 第30-33页 |
| 3.2 蛋白酶加工与成熟方式 | 第33-37页 |
| 4 枯草芽胞杆菌的胞外蛋白酶 | 第37-40页 |
| 4.1 种类、功能及合成 | 第37-39页 |
| 4.2 胞外蛋白酶Bacillopeptidase F(Bpr) | 第39-40页 |
| 5 枯草芽胞杆菌重组、表达体系 | 第40-45页 |
| 5.1 载体系统 | 第41页 |
| 5.2 转化方法 | 第41-43页 |
| 5.3 表达系统 | 第43-44页 |
| 5.4 分泌系统 | 第44-45页 |
| 6 大肠杆菌表达体系及包含体 | 第45-48页 |
| 6.1 大肠杆菌表达体系主要特点 | 第45-46页 |
| 6.2 包含体 | 第46-48页 |
| 7 本研究的目的、内容和意义 | 第48-50页 |
| 第二章 枯草芽胞杆菌LZW胞外蛋白酶Bacillopeptidase F的基因克隆 | 第50-62页 |
| 1 实验材料 | 第50-52页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第50页 |
| 1.2 药品和试剂 | 第50-51页 |
| 1.3 培养基及溶液配制 | 第51-52页 |
| 1.4 仪器设备 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52-57页 |
| 2.1 芽胞杆菌LZW的分离和培养 | 第52-53页 |
| 2.2 芽胞杆菌LZW基因组的提取 | 第53页 |
| 2.3 DNA检测与纯化 | 第53-54页 |
| 2.4 PCR扩增 | 第54-56页 |
| 2.5 重组质粒的构建和克隆 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-61页 |
| 3.1 枯草芽胞杆菌B.subtilis LZW的纤溶活性检测 | 第57页 |
| 3.2 LZW菌株蛋白酶bacillopeptidase F(BprL)基因的克隆与序列分析 | 第57-58页 |
| 3.3 蛋白酶BprL氨基酸序列的同源比对分析 | 第58-61页 |
| 4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第三章 BprL在枯草芽胞杆菌中的表达与加工成熟 | 第62-92页 |
| 1 实验材料 | 第62-65页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第62页 |
| 1.2 药品与试剂 | 第62-63页 |
| 1.3 培养基和溶液配制 | 第63-65页 |
| 1.4 仪器设备 | 第65页 |
| 2 试验方法 | 第65-75页 |
| 2.1 BprL及其相关突变体在枯草芽胞杆菌表达质粒的构建 | 第65-68页 |
| 2.2 枯草芽胞杆菌感受态的制备与转化 | 第68页 |
| 2.3 枯草芽胞杆菌质粒的提取 | 第68-69页 |
| 2.4 BprL及重组蛋白在枯草芽胞杆菌表达检测 | 第69页 |
| 2.5 蛋白质凝胶电泳和定量分析 | 第69-71页 |
| 2.6 蛋白酶酶活测定 | 第71页 |
| 2.7 Western-blot检测 | 第71-72页 |
| 2.8 纤溶活性的测定 | 第72页 |
| 2.9 BprL及其重组蛋白的纯化 | 第72-75页 |
| 3 结果与分析 | 第75-87页 |
| 3.1 构建枯草芽胞杆菌表达BprL的重组质粒 | 第75-76页 |
| 3.2 蛋白酶BprL重组质粒在枯草芽胞杆菌的表达及其检测 | 第76-78页 |
| 3.3 蛋白酶BprL在枯草芽胞杆菌的加工成熟过程分析 | 第78-87页 |
| 4 讨论 | 第87-90页 |
| 4.1 蛋白酶BprL在枯草芽胞杆菌中的表达 | 第87页 |
| 4.2 BprL的成熟酶形式 | 第87-88页 |
| 4.3 BprL在枯草芽胞杆菌中的加工成熟方式 | 第88-90页 |
| 5 本章小结 | 第90-92页 |
| 第四章 BprL在大肠杆菌中的表达及体外加工 | 第92-116页 |
| 1 实验材料 | 第92-94页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第92页 |
| 1.2 药品与试剂 | 第92页 |
| 1.3 培养基和溶液配制 | 第92-93页 |
| 1.4 仪器设备 | 第93-94页 |
| 2 试验方法 | 第94-100页 |
| 2.1 表达载体pET的构建 | 第94-95页 |
| 2.2 蛋白酶BprL及其C端缺失突变体在大肠杆菌表达克隆构建 | 第95-98页 |
| 2.3 BprL及重组蛋白在大肠杆菌中诱导表达 | 第98页 |
| 2.4 重组蛋白纯化的Ni~(2+)亲和层析法 | 第98页 |
| 2.5 抗血清制备 | 第98页 |
| 2.6 变性蛋白的透析复性 | 第98-99页 |
| 2.7 蛋白质的N末端测序 | 第99-100页 |
| 3 结果与分析 | 第100-110页 |
| 3.1 表达载体pET的构建 | 第100页 |
| 3.2 重组BprL及突变体的构建 | 第100-102页 |
| 3.3 重组BprL酶原及其C端序列缺失突变体的表达、复性及加工 | 第102-105页 |
| 3.4 活性位点突变体的加工 | 第105-107页 |
| 3.5 自加工位点附近序列的修饰及其对酶成熟速度的影响 | 第107页 |
| 3.6 BprL体外(in vitro)与体内(in vivo)加工产物的比较 | 第107-110页 |
| 4 讨论 | 第110-115页 |
| 4.1 重组BprL的加工成熟过程 | 第110-112页 |
| 4.2 BprL的C端序列的作用 | 第112-113页 |
| 4.3 N端前肽加工位点序列特征的修饰对BprL酶原成熟的促进作用 | 第113-115页 |
| 5 本章小结 | 第115-116页 |
| 全文总结及展望 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-132页 |
| 在读期间已发表论文 | 第132-134页 |
| 致谢 | 第134页 |
